蒙药验方《亚日饮汤》提取物对H37RV感染小鼠血清IFN-γ的影响

布仁特古斯，陆 宇，马媛媛，照 娜，乌日古玛拉，图门乌力吉*

(1.内蒙古医科大学蒙医药学院，内蒙古 呼和浩特010010；2.北京市胸科医院 药物实验室；3.内蒙古医科大学附属医院 蒙医科)

结核病目前仍然是严重威胁人类健康的重大传染病之一[1]，也是当下仅次于新型冠状病毒肺炎的第二大单一感染源致死原因，对全人类生命健康造成重大威胁[2-4]。2021年10月14日，世界卫生组织(WHO)发布了《2021年全球结核病报告》，全球因新冠肺炎大流行引起结核诊治服务供需中断，导致结核病死亡人数增加、发病率下降趋势缓慢。我国2020年估算的结核病新发患者数为84.2万，在30个结核病高负担国家中我国估算结核病发病数排第2位[5]。因此研发高效、低毒、无耐药、廉价的抗结核新药仍是当务之急。从丰富的民族医药资源中寻找有效的抗结核药物，已引起越来越多国内外研究者的重视[6]。机体在清除结核分枝杆菌过程中CD4+Th1和CD8+T细胞介导的细胞免疫及其分泌的细胞因子如IFN-γ、IL-12起重要作用[7]，《亚日饮汤》是治疗颈部淋巴腺结核蒙药验方，其作用机理至今不清。研究发现该药体外并无抗结核杆菌作用，其代谢产物亦无直接抑制结核杆菌作用[8]。对于结核病体液免疫并无保护作用[9]，因此，认为该药可能通过提高机体细胞免疫功能来发挥治疗结核病的作用。结核病的发病与多种免疫细胞和细胞因子相关，资料显示IFN-γ是与结核病细胞免疫关系最密切的细胞因子[10]，故本研究通过气溶胶建立H37RV感染小鼠模型，给予亚日饮汤治疗后，采用ELISA法测定血清IFN-γ的水平，间接了解该药对细胞免疫功能的影响，预期揭示该药的可能作用机理。

1 材料与方法

1.1 试剂去离子水、1×PBS、2N H2SO4、吐温-20。ELISA检测试剂盒：ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse IFN-γ kit购于Biolegend公司。包被板：ELISA MAXTMUncoted Plates购于Biolegend公司。密封膜、1.5 ml离心管。

1.2 方法

气溶胶感染制备小鼠急性结核病模型，BALB/C小鼠，雄性，体重18-20 g，60只，分空白组；模型组；异烟肼组；亚日饮汤低、中、高剂量组，共6组，每组10只。亚日饮汤提取物小鼠灌胃，高剂量组每日每只216 mg一次灌胃，中剂量组每日每只108 mg一次灌胃，低剂量组每日每只54 mg一次灌胃，阳性药物组(异烟肼)20 mg/kg·天，空白组和模型组给予相同体积生理盐水(不超过1 ml)每日1次，造模后治疗28天。取腹主动脉血1 ml，室温静置凝血后以离心半径 3 cm，3 000 r/min离心20 min，取上清，灭活后过滤除菌保存，采用ELISA方法检测小鼠血清中IFN-γ，实验步骤按照“ ELISA MAXTM Deluxe Set Mouse IFN-γ ”检测试剂盒说明书进行。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 制作标准曲线标准品OD450-OD570差值的均值及设定的浓度值数据见表1，通过散点图添加趋势线的方法，制作标准曲线见图1。

表1 标准品OD450-OD570差值的均值及设定的浓度值(pg/ml)

图1 血清IFN-γ

2.2 根据标准曲线计算样品浓度以OD450—OD570的差值为x值，代入标准曲线y=866.6x-37.06，y值即为样品浓度见图2，模型组、亚日饮汤高、中、低剂量组的水平高于空白组、异烟肼组(P<0.05)，亚日饮汤高、中、低剂量组的水平高于模型组(P<0.05)。见表2。

图2 血清IFN-γ

表2 血清IFN-γ浓度在空白组、模型组、异烟肼组、亚日饮汤组表达水平比较

3 讨论

结核分支杆菌感染机体后是否发病取决于结核菌的数量、毒力和机体的免疫状态，细胞免疫在抗结核保护性免疫中起主要作用[6]。IFN-γ可增加感染了结核分支杆菌的巨噬细胞活性氧中介物(ROI)和活性氮中介物(RNI)的产量来杀伤细菌[11]，IFN-γ还能增加高亲和力Fc受体在单核细胞、巨噬细胞表面表达，促进这些细胞参与抗体依赖的细胞毒反应[12]。IFN-γ是机体发挥抗结核保护性免疫的重要细胞因子，其在机体的水平与结核的发生、发展、病程密切相关，它可通过促进T细胞的增殖和分化，激活巨噬细胞，参与结核病的肉芽肿免疫反应等多方面发挥抗结核免疫作用[13]。IFN-γ在活动性肺结核患者中存在明显缺陷，导致个体肉芽肿形成少且组织坏死严重[14]。研究结果显示许多中药具有提高细胞免疫功能，从而有间接治疗结核病作用[15]。中草药免疫治疗主要是非特异性调整人体免疫功能，如黄芪多糖、枸杞子多糖、刺五加多糖等能促进IL-2、IL-3、IFN-γ 等细胞因子的分泌，明显地提高机体的细胞免疫和体液免疫功能[16-17]。本研究结果显示血清IFN-γ在亚日饮汤高、中、低剂量组的水平均高于空白组、模型组、异烟肼组(P<0.05)，证明亚日饮汤具有提高小鼠血清IFN-γ水平的作用，异烟肼组水平低于空白组，可能与异烟肼属于一线抗结核药物，具有直接杀伤结核杆菌作用，并非与提高免疫功能有关，空白组水平低于模型组，因空白组未曾受到H37RV感染，故只表现出固有免疫状态，模型组水平高于空白组和异烟肼组，是因模型组受到H37RV感染后，血清IFN-γ水平有所升高，表明小鼠原有免疫状态，但其水平升高明显不及亚日饮汤组。综上所述，我们认为亚日饮汤可以提高H37RV感染小鼠模型血清中的IFN-γ水平，可能是该药治疗结核病作用机制之一。