鱼腥草素钠联合亚胺培南西司他丁钠对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌体外抑菌作用的研究*

周孟杰，毛建梅， 蔡 燕

(川北医学院附属医院：1.检验科；2.产前诊断中心；3.风湿免疫研究所，四川南充 637000)

鲍曼不动杆菌是医院感染中重要的多重耐药细菌之一，其感染死亡率可达35%[1]。2019年全国细菌耐药监测数据显示，鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率高达55.5%和57.1%，并呈现多重耐药[2]，致使临床能选择的抗菌药物越来越少。鱼腥草具有抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等均具有抑菌作用[3]，复方鱼腥草能抑制鲍曼不动杆菌生长[4]。本研究以鱼腥草挥发油中的活性成分癸酰乙醛亚硫酸钠加成物(即鱼腥草素钠)为研究对象[3]，对鱼腥草素钠联合亚胺培南西司他丁钠对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌(carbapenem resistant acinetobacter baumannii,CRAB)的抑菌效果进行研究，以期为中药治疗CRAB感染提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1实验菌株来源

收集2018年1-4月川北医学院附属医院微生物室鉴定分离的10株CRAB，均为呼吸道来源标本；质控菌株ATCC19606为川北医学院附属医院风湿免疫研究所保存的菌株。

1.1.2仪器和主要试剂、药品

SJ-CJ-2FD超净工作台、THZ-92A恒温空气摇床、DHP 420电热恒温培养箱、P200+超微量核酸蛋白分析仪、Tecan微孔板酶标仪。鱼腥草素钠(西安开来生物工程有限公司，规格10.0 g，批号K187155)；亚胺培南西司他丁钠(美国Merck Sharp & Dohme Corp公司，规格1.0 g，其中含亚胺培南500 mg，西司他丁钠500 mg，批号S026857)；四甲基偶氮唑蓝(MTT，德国BioFroxx公司，批号EZ6688D183)；水解酪蛋白(MH)培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)，MH琼脂培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)，二甲基亚砜(DMSO,成都市科隆化学品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1菌悬液制备

将10株CRAB及ATCC19606在MH琼脂平板中划线培养9～12 h，挑取单克隆菌落接种于1 mL MH肉汤培养基中，置于37 ℃空气恒温摇床(120 r/min)培养10～12 h。将过夜培养的菌液离心(8 000 r/min)3 min，去上清液，加入1 mL生理盐水重悬菌液；用超微量核酸蛋白分析仪在600 nm处检测菌液吸光度(A)值，并用生理盐水将菌液A值调至1.0 (约等于0.5麦氏浊度，菌量约1.5×108cfu/mL)，再用MH液体培养基将菌液稀释1 000倍，放置于4 ℃冰箱中，30 mim内使用。

1.2.2微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)

1.2.2.1MH肉汤培养基制备

称取6.25 g MH肉汤培养基于螺口试剂瓶中，加入250 mL去离子水，震荡摇匀使培养基溶解，121 ℃高压灭菌20 min，生物安全柜放凉备用。

1.2.2.2药物配制

电子天平准确称取鱼腥草素钠粉剂，加入灭菌MH肉汤培养基，用漩涡震荡仪震荡混匀，配制成浓度为500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500、5 000、5 500 μg/mL的鱼腥草素钠MH溶液；吸取1 mg/mL的亚胺培南西司他丁钠原液，按上述方法配制成浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 μg/mL的亚胺培南西司他丁钠MH溶液；用生理盐水配制浓度为5 mg/mL MTT溶液，以上溶液用0.25 μm的细菌滤器过滤后备用，放置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.2.3接种

取无菌的96孔板，各取20 μL稀释好的菌悬液和含药MH液体培养基80 μL接种到96孔板对应的孔中，设置不含细菌的亚胺培南西司他丁钠药物对照、不含细菌的鱼腥草素钠药物对照、不含细菌及药物的MH阴性对照、不含药物的细菌阳性对照；每孔液体总体积100 μL，不足者以MH培养基补入。每个药物浓度设置3个复孔。加样完毕后置于37 ℃空气摇床震荡(100 r/min)培养8～9 h。到达培养时间后，每孔加入10 μL 浓度为5 mg/mL MTT，放置于37 ℃空气摇床震荡(100 r/min)培养2 h，加入100 μL DMSO，放置于震荡(100 r/min)摇床10 min，将肉眼观察无细菌生长的培养孔所对应的药物浓度作为相应菌株的MIC。

1.2.3琼脂二倍稀释法测定MIC

1.2.3.1含药MH琼脂平板制备

制备鱼腥草素钠含药MH琼脂平板浓度为250、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500 μg/mL,亚胺培南西司他丁钠含药MH琼脂平板浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL。含药MH琼脂平板按V药物∶V琼脂培养基=1∶9比例，总体积10 mL。用电子天平称取鱼腥草素钠粉剂所需量及移液枪准确吸取所需亚胺培南西司他丁钠原液量并加入无菌试管，加入1 mL灭菌MH液体培养基并混匀；MH琼脂培养基用去离子水溶解后高压灭菌，待冷却至60 ℃左右用无菌吸管吸取9 mL至无菌试管，吹打混匀后倒入无菌平板，制成含药MH琼脂平板。凝固后密封保存，放置于4 ℃冰箱备用，放置时间不要超过10 d。

1.2.3.2接种

用生理盐水将过夜培养的10株菌株及ATCC19606的菌液A值调至1.0，并用MH液体培养基将菌液稀释1 000倍备用。取2 μL接种于划区的含药MH琼脂平板，设置1个平行对照，放入37 ℃孵箱中正面放置30 min，待干后将培养皿倒置，培养9～10 h后，在接种区域加入5 μL浓度为5 mg/mL 的MTT,放置于孵箱中孵育1 h后观察结果。将肉眼观察无细菌生长或生长明显受抑制的培养孔所对应的药物浓度作为相应菌株的MIC，实验重复3次。

1.2.4微量肉汤稀释法-棋盘滴定法检测联合抑菌作用

根据MIC值分别设定2种药物终浓度为2 MIC,1 MIC,1/2 MIC,1/4 MIC,1/8 MIC,1/16 MIC，采用棋盘滴定法测分级抑制浓度。设置药物对照、MH阴性对照、阳性对照。每孔总体积100 μL，其中鱼腥草素钠80 μL，亚胺培南西司他丁钠10 μL，菌液10 μL。加样完毕后放置于37 ℃空气摇床震荡(120 r/min)培养9 h，加入MTT 10 μL，放入37 ℃空气摇床震荡(120 r/min)培养1 h，加入100 μL DMSO，轻轻震荡混匀10 min，肉眼观察以未出现细菌生长的孔对应的浓度为MIC值，实验重复3次。

1.3.5琼脂二倍稀释法检测联合抑菌作用

根据菌株单药时MIC值设定联合用药浓度，鱼腥草素钠浓度值为4 000、2 000、1 000、5 00、250、0 μg/mL与亚胺培南西司他丁钠浓度值80、40、20、10、0 μg/mL联合用药组合制作含药平板，设置阳性对照、空白对照。取2 μL菌液接种于划区的平皿，设置1个平行对照，放入37 ℃孵箱中正面放置30 min，待干后将培养皿倒置，培养9 h后，在接种区域加入5 μL浓度为5 mg/mL的MTT,放置于孵箱中孵育1 h，观察结果。将肉眼观察无细菌生长的培养孔所对应药物浓度作为相应菌株的MIC，实验重复3次。

1.3.6部分抑菌浓度(fractional inhibitory concentration,FIC)和部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI)计算

2 结 果

2.1 微量肉汤稀释法和琼脂二倍稀释法单药MIC值

根据肉眼观察无细菌生长的培养孔对应的药物浓度作为MIC值，微量肉汤稀释法中亚胺培南西司他丁钠对CRAB的MIC在20～45 μg/mL，琼脂二倍稀释法中亚胺培南西司他丁钠对CRAB的MIC在25～55 μg/mL。参照临床实验室标准化学会耐药折点药敏结果判定标准进行结果判读，10株实验菌株均为亚胺培南西司他丁钠耐药菌株。鱼腥草素钠能抑制CRAB的生长，结果显示在微量肉汤稀释法中鱼腥草素钠对CRAB的MIC在1 500～3 500 μg/mL，琼脂二倍稀释法中鱼腥草素钠对CRAB的MIC在2 500～3 000 μg/mL。见表1。

2.2 亚胺培南西司他丁钠和鱼腥草素钠的联合抑菌效果

本实验采用2种方法检测亚胺培南西司他丁钠(A药)和鱼腥草素钠(B药)的联合抑菌效果，在培养孔中未见细菌生长且FICI≤1时其联合抑菌效果表现为协同作用。以3号菌株为例，在微量肉汤稀释法中亚胺培南西司他丁钠(A药)MIC值为25 μg/mL,鱼腥草素钠(B药)MIC值为2 500 μg/mL；在琼脂二倍稀释法中亚胺培南西司他丁钠(A药)MIC值为80 μg/mL(解释：琼脂稀释法中鱼腥草素钠浓度采用4 000、2 000、1 000、5 00、250、0 μg/mL、亚胺培南西司他丁钠浓度80、40、20、10、0 μg/mL制作含药MH琼脂平板),鱼腥草素钠(B药)MIC值为4 000 μg/mL，图1B、图2C所示白色区域表示对应的培养孔中无肉眼可见细菌生长，且2种药物联合时FICI≤1；3号菌株FICI在0.5～1.0，根据FICI值判读2种药物对3号菌株的联合抑菌效果为协同作用,见图1、2。

表1 微量肉汤稀释法和琼脂稀释法单药MIC值(μg/mL)

A:微量肉汤稀释法-棋盘滴定法检测联合抑菌作用;B:3号菌株联合用药结果。亚胺培南西司他丁钠(A药)MIC值为25 μg/mL,鱼腥草素钠(B药)MIC值为2 500 μg/mL。B图黑色区域表示对应的孔中有肉眼可见的细菌生长；灰色区域表示对应孔中无细菌生长，且FICI>1.00；白色区域中孔中无肉眼可见细菌生长，且FICI在0.50～1.00。3号菌株FICI在0.50～1.00，两种药物对3号菌株的联合抑菌效果为相加作用。

2.3 FIC和最优FICI

鱼腥草素钠对CRAB的FIC值与亚胺培南西司他丁钠对CRAB的FIC值相加，将数值最小的FICI值作为最优部分抑菌浓度指数，结果显示在微量肉汤稀释法和琼脂二倍稀释法中，其最优FICI值在0.5～1.0，均表现为相加作用。在微量肉汤稀释法中，亚胺培南西司他丁钠与不同浓度鱼腥草素钠联合时，亚胺培南西司他丁钠MIC值可下降1～3个稀释浓度；在琼脂二倍稀释法中亚胺培南西司他丁钠与鱼腥草素钠联用其MIC值可下降1～2个稀释浓度。根据FICI值结果判读标准，鱼腥草素钠联合亚胺培南西司他丁钠对10株CRAB的联合用药效果均表现为相加作用，且2种实验方法评价结果一致。见表2。

A:琼脂二倍稀释法检测联合抑菌作用;B:琼脂二倍稀释法接种示意图;C:3号菌株联合用药结果。亚胺培南西司他丁钠(A药)MIC值为80 μg/mL,鱼腥草素钠(B药)MIC值为4 000 μg/mL。C:黑色区域对应的孔中有肉眼可见的细菌生长；灰色区域对应孔是鱼腥草和培养基的颜色其中无细菌生长，且FICI>1.00；白色区域对应孔中无肉眼可见细菌生长，且FICI在0.50～1.00。3号菌株FICI在0.75～1.00，2种药物的联合抑菌效果为相加作用。

表2 微量肉汤稀释法和琼脂二倍稀释法联合抑菌最优FICI结果

3 讨 论

随着社会老龄化趋势，医院中高龄的重症患者、多基础疾病患者数量增加，住院时间长、侵入性检查治疗等危险因素导致医院鲍曼不动杆感染率上升[7]。亚胺培南是碳青霉烯抗生素的代表药物，是非典型β-内酰胺类抗生素，其具有杀菌能力强、超广谱抗菌活性等优点[8]，是治疗鲍曼不动杆菌感染的常选药物。但随着亚胺培南西司他丁钠在临床上的广泛使用，以及鲍曼不动杆菌天然感受态特性，使其拥有获得外源性耐药基因的能力，CRAB的检出率不断上升。鲍曼不动杆菌的耐药机制与产生抗菌药物相关的酶类、药物作用靶点改变、膜孔道蛋白的缺失、外排泵过度表达、可移动遗传元件如整合子、生物被膜等因素有关[9]。多重耐药鲍曼不动杆菌感染可供选择的抗菌药物很少，即使菌株对替加环素和多粘菌素的敏感率相对较高，但单药治疗失败率高，且这些药物不良反应大。多粘菌素常见的不良反应有肾毒性，会造成急性肾损伤[10];替加环素最常见不良反应有恶心、呕吐、腹泻等胃肠道反应[11]，给鲍曼不动杆菌感染的治疗带来困境。

随着细菌耐药形势的加剧，越来越多的目光聚集到传统医学。传统医学中抗菌植物是新型抗菌化合物的重要来源，世界范围内批准的药物中大部分来源于天然产品，大部分药物都是从天然植物中提取的[12]。鱼腥草具有“中药抗生素”之称，其鱼腥草注射液临床上常用于上呼吸道感染、盆腔炎、尿路感染等疾病的治疗且价格便宜，但由于其可能导致严重过敏反应，限制了临床的广泛应用。中药复方制剂成分和药理作用复杂多样，可能造成药物不良事件。鱼腥草素钠在临床用药上以静脉注射、肌肉注射效果优于口服用药，但用药安全性和有效性的问题仍需解决，中药单体因纯度高、成分明确、活性高成为研究的重点。鱼腥草素钠具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫力、抑菌、抗病毒的作用[13]，对多种革兰阳性细菌和革兰阴性细菌如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌、卡他球菌、白喉杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肠炎杆菌等均有不同程度的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及枯草杆菌的抑菌结果较强[14]；鱼腥草素钠可增强金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌生物被膜早期黏附的清除作用，抑制生物被膜形成[15]。

综上，本研究结果显示鱼腥草素钠能抑制耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌生长，在微量肉汤稀释法中检测到MIC在1 500～3 500 μg/mL，琼脂二倍稀释法中MIC在2 500～3 000 μg/mL，与亚胺培南西司他丁钠联用后能增加其抑菌效果，使亚胺培南西司他丁钠的MIC下降，其最优FICI在0.5～1.0，2种药物联合效应为相加作用。采用微量肉汤稀释法和琼脂稀释法2种方法进行体外抑菌实验，2种方法结果一致。但是鱼腥草素钠的抑菌机制目前暂不清楚，可能与抑制细菌生物被膜形成有关、抑制细菌主动外排泵、消除耐药质粒等有关，其机制需要进一步进行研究。