血清miR-146a、miR-638水平与非小细胞肺癌患者化疗耐药性的相关性

郑晶冰

作为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的常用治疗手段，化疗可有效杀灭癌细胞，改善患者病情，延长生存时间。但部分NSCLC患者接受化疗后会出现化疗耐药性，影响治疗效果，甚至造成治疗失败，不利于预后[1]。因此，早期预测NSCLC化疗患者是否发生耐药对提高化疗效果，改善患者预后具有重要意义。目前，临床已有研究指出，微小核糖核酸(MicroRNA，miR)与多种癌症疾病的化疗耐药性密切相关[2]。研究指出，miR可通过翻译抑制或信使RNA降解，调节基因表达，其已成为NSCLC的诊断标志物之一[3]。作为miR中的常见类型，miR-146a可与原癌基因启动子区相互结合，降低原癌基因表达，进而抑制肿瘤细胞增殖和转移[4]；miR-638已被研究证实具有类似抑癌基因的作用，增加肝细胞癌预后不良风险[5]。由上述miR-146a、miR-638在肿瘤疾病中的作用特点，推测血清miR-146a、miR-638水平可能与NSCLC患者化疗耐药性有关。既往研究多关注miR-146a、miR-638与肿瘤患者的预后、转移及细胞迁移、侵袭方面[6]，而关于化疗耐药方面的研究较少。基于此，本研究将重点分析血清miR-146a、miR-638水平与NSCLC患者化疗耐药性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2019年1月至2020年2月接受化疗且化疗结束后产生耐药性的62例NSCLC患者作为耐药组，同期纳入接受化疗且化疗结束后未产生耐药性的62例NSCLC患者作为敏感组。纳入标准：①符合NSCLC相关诊断标准[7]，且经影像学、细胞学检查确诊；②预计生存时间>3个月；③恶性肿瘤国际临床病理分期(tumor lymph node metastasis，TNM)[8]为ⅢB期；④全部患者均接受相同的同步放化疗方案，且放化疗周期一致；⑤患者病历资料、影像学检查结果等资料均完整。排除标准：①伴有其他胸廓内肿瘤的患者；②既往接受手术治疗的患者；③合并传染性疾病的患者；④合并败血症的患者；⑤血小板<80×109/L的患者。2组一般资料比较(P>0.05)，具有可比性。见表1。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 全部患者均接受相同的同步放化疗方案。化疗采用EP方案：第1、8天，静脉滴注顺铂50 mg/m2，正规水化、利尿；第1～5天，静脉滴注依托泊苷50 mg/m2，1次/天。每4周重复，化疗2个周期，同步接受三维适形放疗，单次剂量46～50 Gy，每周进行5次，共进行10次。

1.2.2 化疗耐药性(胶滴肿瘤药物检测法)检测方法 化疗结束1 d时，患者接受纤维镜活检，取0.5～1 mm的新鲜肿瘤组织，使用组织消化酶进行消化，消化后使用筛网进行过滤，最后使用湖南迈克尔实验仪器有限公司的KC-42B低速离心机进行离心处理，以3000 r/min的离心速度，共离心10 min，离心完毕后取下部分，并将其加入在含有10%胎牛血清的RPM1-1640培养基中，制备细胞混悬液。在冰浴环境下，制备细胞-胶原蛋白混合液，接种在24孔的细胞培养板。24 h后，加入血浆药物浓度的顺铂，静置24 h。实验过程中涉及无药物的空白组。结果判定标准[9]：采用含药组的细胞数量/空白组数目的百分比评估药物敏感性，若<50%则判定为化疗敏感，≥50%则为化疗耐药，分别纳入耐药组和敏感组。

1.2.3 基线资料调查方法 自制基线资料调查问卷，记录患者一般情况，包括：①年龄；②肿瘤直径；③病理类型；④饮酒史：饮酒时间>5年，每次摄入酒精量>10 g；⑤吸烟史：连续或累计吸烟6个月或以上；⑥病程。

1.2.4 实验室指标检测方法 (1)血清糖类抗原(carbohydrate antigen，CA)125、CA199：采集患者化疗前1 d的清晨空腹静脉血5 ml，以8000 r/min的离心速度共离心6 min，离心完毕后取上清液待检。使用上海酶联生物的试剂盒，采用酶联免疫吸附试验法测定血清CA125、CA199水平。(2)血清miR-146a、miR-638：采集患者化疗前1 d的清晨空腹静脉血3 ml，使用长沙英泰仪器有限公司的TD4A型低速医用离心机进行离心处理，以3000 r/min的离心速度，共离心10 min，离心完毕后取上清液待检。以总RNA 5 μl为模板，使用美国应用生物系统公司的试剂盒进行逆转录合成互补脱氧核糖核酸(Complementary DNA，cDNA)。总反应体系为15 μl，反应条件如下：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。miR-146a的正向引物序列为：5'-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3'，反向引物序列为：5'-CGAGAAGCTTGCATCACCAGAGAACG-3'。内参基因U6上游序列为：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游序列为：3'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5'。miR-638的正向引物序列为：5'-TTGGCCTACCTATAACT-GG-3，反向引物序列为：S'-CTGTAATATGCGGTAAGTCTd。以cRNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增。扩增条件：95 ℃10 min，95 ℃ 45 s，58 ℃ 20 s，40个循环。以U6为内参照，U6正向引物序列为：5'-ATTG-GAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物序列为：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，计算miR-146a 的相对定量表达水平(ΔCt=CtmiR-146a-CtU6)及miR-638 的相对定量表达水平(ΔCt=CtmiR-638-CtU6)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 2组患者基线资料、实验室指标对比

耐药组血清miR-638 mRNA相对表达量水平低于敏感组，miR-146a mRNA相对表达量高于敏感组，差异统计学意义(P<0.05)，组间其他资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组患者基线资料、实验室指标对比

2.2 NSCLC患者化疗耐药性与血清miR-146a mRNA相对表达量、miR-638 mRNA相对表达量的相关性分析

经Kendall's tau-b相关性检验结果显示，NSCLC化疗耐药性与血清miR-638 mRNA相对表达量水平呈负相关(γ=-0.707，P<0.001)，与血清miR-146a mRNA相对表达量水平呈正相关(γ=0.687，P<0.001)。

2.3 血清miR-146a mRNA相对表达量、miR-638 mRNA相对表达量预测NSCLC患者化疗耐药性风险的效能分析

将化疗前血清miR-146a mRNA相对表达量、miR-638 mRNA相对表达量水平作为检验变量，NSCLC患者化疗耐药性情况作为状态变量(1=耐药，0=敏感)，绘制ROC曲线(见图1)，结果显示，血清miR-146a mRNA相对表达量、miR-638 mRNA相对表达量单独及联合预测NSCLC患者化疗耐药风险的AUC均>0.70，预测价值较理想，且以化疗前血清miR-146a mRNA相对表达量、miR-638 mRNA相对表达量cut-off值取2.845、1.875时，联合预测的价值最好。见表2。

图1 血清miR-146a、miR-638 mRNA相对表达量预测NSCLC患者化疗耐药性风险的ROC曲线图

表2 血清miR-146a、miR-638 mRNA相对表达量预测NSCLC患者化疗耐药性风险的效能

3 讨论

化疗已被证实是癌症的常用治疗方法，但部分患者对化疗药物存在不同程度的耐药，当患者出现化疗耐药时，不仅会影响化疗效果，还会增加病情恶化风险，不利于预后[10]。因此，为降低NSCLC患者的化疗耐药性，需早期预测患者化疗耐药性发生风险，并给出针对性建议。

研究表明，细胞凋亡与化疗耐药性密切相关，凋亡因子的异常表达可降低化疗药物对肿瘤细胞的促凋亡作用，增加耐药性风险[11-12]。miRNA可调节notch、mTOR信号转导通路等多条肿瘤细胞信号转导通路，研究表明，miRNA与肿瘤细胞凋亡、浸润转移等密切相关[13]。作为miRNA类型中的一种，miR-146a可与靶基因巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)结合后抑制靶基因MIF表达，而MIF的编码蛋白主要由T淋巴细胞分泌，能够抑制肿瘤细胞中的巨噬细胞发挥招募、迁徙等功能，从而抑制巨噬细胞功能，促进肿瘤发展。此外，研究表明，miR-146a可影响c-Jun氨基末端激酶基因表达，从而参与调控NSCLC肿瘤细胞的增殖与凋亡[14]。miR-638也是miRNA中的一种，已被研究证实在多种恶性肿瘤中的表达下调，表明miR-638在肿瘤发生、发展中可能具有负向调控的作用。研究表明，miR-638与顺铂诱导的细胞凋亡存在密切关联[15]。因此，结合上述，推测血清miR-146a、miR-638可能与NSCLC化疗耐药性有关。本研究结果显示，耐药组血清miR-638 mRNA相对表达低于敏感组，miR-146a mRNA相对表达高于敏感组，且经双变量Kendall直线相关性检验结果显示，NSCLC化疗耐药性与血清miR-638 mRNA相对表达量呈负相关，与血清miR-146a mRNA相对表达量呈正相关。表明血清miR-638 mRNA相对表达量、miR-146a mRNA相对表达量与非小细胞肺癌患者化疗耐药性具有相关性。分析其可能的原因为：原癌基因(C myc oncogene，c-Myc)与细胞增殖、抑制凋亡等过程有关，当c-Myc缺失、突变时导致肿瘤细胞凋亡异常，继而降低化疗药物诱导细胞凋亡的能力，增加化疗耐药性[16]。miR-146a可通过降低核因子激活的B细胞的κ-轻链增强(nuclear factor Kappa Beta，NF-κB)的表达，促使c-Myc的蛋白表达下降，促使化疗药物诱导细胞凋亡过程发生异常，导致化疗耐药情况发生[17]。作为一种癌基因，B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)与细胞凋亡抑制有关，研究表明，Bal-2表达产物可阻断或阻碍化疗药物诱导细胞凋亡进程，促使肿瘤细胞对化疗药物产生耐受[18]。研究指出，miR-638表达上调，可抑制癌基因bcl-2的表达，促进细胞凋亡，降低细胞对化疗药物产生耐药性[19]。最后本研究对血清miR-146a mRNA相对表达量、miR-638 mRNA相对表达量预测患者化疗耐药风险绘制了ROC曲线，结果显示，血清miR-146a mRNA相对表达量、miR-638mRNA相对表达单独及联合预测NSCLC患者化疗耐药风险的AUC均>0.70，预测价值较理想，且以联合预测的价值最好。上述结果均证实，NSCLC患者化疗前血清miR-146a mRNA相对表达量、miR-638 mRNA相对表达量不仅是患者发生化疗耐药性的风险因子，且可作为评估患者发生化疗耐药性的关键标志物。上述结果也表明，临床早期监测NSCLC患者化疗前血清miR-146a mRNA相对表达量、miR-638 mRNA相对表达量，可在积极治疗原发病的同时实施合理干预，如提高患者免疫功能，中西医结合治疗等，可能对降低化疗耐药性发生风险、提高化疗效果有积极意义。虽本研究得到了血清miR-146a mRNA相对表达量、miR-638 mRNA相对表达量与NSCLC患者化疗耐药有关，但该结果可能会受研究设置条件、样本量小等因素影响而导致结果出现偏倚，未来还需进一步开展研究、探索。

综上所述，NSCLC患者化疗前血清miR-146a mRNA、miR-638 mRNA相对表达量与化疗耐药有关，临床可考虑通过检测NSCLC患者化疗前血清miR-146a mRNA、miR-638 mRNA相对表达量，分析患者化疗耐药风险，以尽早予以合理干预。