湿度对球孢白僵菌和玫烟色虫草田间防治棉蚜效果的影响

葛银银，王 滨

（1.安徽农业大学微生物防治省重点实验室，合肥 230036；2.安徽省黄山市黄山区林业局，黄山 242700）

棉蚜Aphisgossypii，是一种世界分布的经济害虫，其年发生代数多, 繁殖力强，是棉花、瓜类、洋麻等多种作物上的重要害虫之一[1]。防治上主要依赖于化学防治，目前对氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷、有机氯、新烟碱类等多种杀虫药剂已经产生了抗性[2]，化学农药的使用不仅严重污染环境，而且对草蛉类和瓢虫类等天敌昆虫种群动态有较大影响[3]，生态环境遭到破坏的同时也威胁到人类的健康。

昆虫病原真菌因为具有直接从昆虫体壁侵入杀死害虫的独特致病机理，而成为化学农药替代品的首选微生物农药[4]。目前在害虫防治研究中涉及最多的昆虫病原真菌种类是虫草属和白僵菌属真菌，其中玫烟色虫草Cordyceps（=Isaria）fumosorosea和球孢白僵菌Beauveriabassiana就是很好的生防菌，玫烟色虫草旧称玫烟色拟青霉Paecilomycesfumosoroseus，后来移入棒束孢属Isaria[5]，玫烟色虫草寄主范围广，包括半翅目、鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等8目[6]，能侵染桃小绿叶蝉Empoascaflavescens、棉蚜、烟粉虱Bemisiatabaci、桃蚜Myzuspersicae、小菜蛾Plutellaxylostella、菜青虫Pierisrapae、柑橘粉蚧Planococcuscitri等40多种昆虫[7-9]，尤其对刺吸式口器害虫有很高的致病力[10]。球孢白僵菌在我国20世纪50年代开始研究，至今有70年左右的历史[11]，作为生物农药大规模生产和使用也有50余年历史。球孢白僵菌作为环境友好的真菌杀虫剂在世界范围内被广泛应用[12-14]。

球孢白僵菌和玫烟色虫草等昆虫病原真菌的孢子萌发与致病性往往受到环境因子，尤其是湿度因子的影响[15]。很多研究证实，环境湿度过低会影响昆虫病原真菌对害虫的侵染，降低田间防治效果[16]，而高湿环境则可以取得良好的防治效果[17-19]。这意味着调节田间应用的环境湿度可能会直接影响到昆虫病原真菌对害虫的防治效果。

本研究在应用球孢白僵菌Bb202和玫烟色虫草Ifu13a喷雾防治棉蚜后，通过人工喷洒水雾的方法增加环境相对湿度，研究在环境湿度调节下，这两种昆虫病原真菌在不同应用剂量下对环境湿度变化的响应及对目标害虫棉蚜防治效果的影响，研究将为真菌生物农药田间湿度调控的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验器材

试验中所使用的器材见表1。

表1 本试验所用到的主要器材Table 1 Main equipment used in this experiment

1.2 供试菌株

球孢白僵菌Bb202原寄主为鞘翅目天牛，玫烟色虫草Ifu13a原寄主为半翅目粉虱，两种菌株都保存于安徽农业大学微生物防治省重点实验室RCEF菌种库。

1.3 供试菌株孢子悬浮液的制备

将4 ℃冰箱保存的球孢白僵菌Bb202和玫烟色虫草Ifu13a按照王滨等[20]孢子悬浮液制备方法进行菌株培养、孢子收集与孢子悬浮液制备。最终制成1.0×108、1.0×107和1.0×106孢子/mL浓度的孢子悬浮液用于后续的蚜虫田间防治。

1.4 试验地设置

试验设置在安徽农业大学植物园海桐板块区，试验前对海桐定期浇水以确保植物生长良好。每个试验处理区的海桐面积约12 m2（长4.0 m×宽3.0 m）。施药之前，按对角线取样方法，随机挑选3棵海桐；每棵海桐按不同方位选取虫口密度比较均匀的枝条作为取样枝条，并用毛笔将枝上的吹绵蚧、蚂蚁、瓢甲等其他昆虫进行完全清理，仅保留蚜虫进行防效调查，每个样枝挂上标签并记录时间与虫口基数。

1.5 菌株的田间应用浓度与湿度调控设计

1.5.1 田间应用浓度 球孢白僵菌和玫烟色虫草均设置1.0×108、1.0×107和1.0×106孢子/mL 3个孢悬液浓度处理组及0.05% Tween-80空白对照。

1.5.2 环境湿度调节 在田间喷雾防治后的第2 d、第3 d，用超低量喷雾器每天3次对防治区湿度调控处理组的海桐冠层进行补湿喷雾，以提高植物冠层的相对湿度。相对湿度数值由置于冠层的便携式湿度计测定。非湿度调节处理组则保持自然环境状态。每个菌株3个浓度，共8个处理。每处理3次重复。

1.6 田间喷药防治与田间湿度调控

2018年9月10日、2018年10月1日、2019年3月13日和2018年9月22日、2018年10月23日、2019年3月19日，在试验地分别进行了3次球孢白僵菌和3次玫烟色虫草防治棉蚜的田间防治试验。孢子悬浮液采用背负式超低量喷雾器（Evivk，UK）进行喷雾施药。作业参数为：喷雾量10 L/h，雾滴直径小于50 μm，喷雾器档位3档，喷雾作业距离2 m，每处理区喷雾20 s/往复4次。每次喷雾施药均在下午5～6点进行。每次均实地记录了试验期间天气情况和试验地的温度和湿度。

在6次田间试验喷雾后，第2 d和第3 d每天分早（8：00）、中（11：00）、晚（17：00）3次用背负式超低量喷雾器对湿度调控试验区的海桐进行喷水雾补湿，补湿标准为海桐全株叶片充分润湿而无明显滴水。

1.7 田间喷雾量监测与防效调查

1.7.1 喷雾量监测 每次施药前在每棵抽样海桐的梢部周围随机抽取3片叶片，在每片叶片背面固定一张水敏纸。喷药后立即带水敏纸装入小塑料袋，带回实验室计算雾滴密度，并采用雾滴分析软件（重庆六六山下植保科技有限公司）估算单位面积叶片上的孢子悬浮液的沉积量。

1.7.2 防效调查 在田间喷雾施药后，每隔1 d调查1次、记录样本枝条上的棉蚜虫口数量。

1.8 数据统计与分析

虫口减退率（%）＝（处理前虫口数－处理后虫口数）/处理前虫口数×100；校正防治效果（%）＝（处理后虫口减退率－对照组虫口减退率）/（1－对照组虫口减退率）×100。

采用Excel 2010和SPSS 22.0软件进行Duncans氏新复极差显著性分析（P＜0.05）和Probit回归分析得出LC50和LT50值。

2 结果与分析

2.1 田间防治试验期间的气象因子监测

试验地气象因子的数据监测在田间喷雾施药后均持续8 d，6次田间试验监测到的环境温湿度变化情况如图1。同时记录到整个田间试验过程中，有5次降雨，分别是2018年9月13日，雷阵雨；2018年9月16日，雷阵雨；2018年9月17日，雷阵雨；2018年10月25日，小雨；2019年10月8日，小雨。

图1 田间试验时的环境平均温度和平均相对湿度Fig.1 Average temperature and relative humidity in the period of field trials

从图中曲线数据和变化来看，球孢白僵菌防治棉蚜的3次田间试验的环境平均气温，最高26 ℃，最低12.5 ℃；平均相对湿度一般在60%～80%，偶有低于60%和高于80%的。玫烟色虫草防治棉蚜3次田间试验的环境平均气温，最高24 ℃，最低7.5 ℃；平均相对湿度在70%～90%范围波动。总体来说，玫烟色虫草和球孢白僵菌在棉蚜田间防治试验中环境的平均温度差异性较小，但在玫烟色虫草防治棉蚜的田间平均相对湿度整体稍高。

2.2 田间防治试验的喷雾量监测

将带回的水敏纸先扫描成图片，再利用雾滴分析软件进行雾滴分析，玫烟色虫草第1次田间施药落到叶面的平均沉积量为15.2 μL/cm2，第2次施药为14.8 μL/cm2，第3次施药为14.0 μL/cm2。球孢白僵菌第1次田间施药的雾滴平均沉积量为14.5 μL/cm2，第2次施药为15.0 μL/cm2，第3次施药为14.0 μL/cm2。3次田间施药的超低量喷雾操作一致性良好。

2.3 自然条件下两种昆虫病原真菌对棉蚜的防治效果

田间自然条件下，玫烟色虫草Ifu13a对棉蚜的防治，从第4 d开始，1×108和1×107孢子/mL处理组的棉蚜虫口减退率显著高于空白对照组；第8 d时，1×108、1×107、1×106孢子/mL处理组的虫口减退率为分别为67.31%、52.72%和24.12%，均与空白对照组差异显著。玫烟色虫草Ifu13a在田间自然防治棉蚜过程中，表现出了明显的剂量效应，即防治时喷施的孢子浓度越高，棉蚜种群的虫口减退率就越高，防治效果差异出现的时间就越早（图2A、B）。第8 d时，1×108、1×107和1×106孢子/mL处理组的校正防治效果分别为63%、46%和27%。

图2 自然条件下玫烟色虫草Ifu13a对棉蚜种群的田间控制作用Fig.2 Field control of A.gossypii population by C.fumisorosea Ifu13a under natural conditions

在田间自然条件下，球孢白僵菌Bb202对棉蚜的防治，从第4 d开始，所有球孢白僵菌试验区的棉蚜虫口减退率均与空白对照差异显著，1×108、1×107和1×106孢子/mL试验区的虫口减退率分别为31.04%、29.12%和10.55%，而空白对照区的种群数量开始上升，虫口增长率为2.55%（图3A）。各防治试验区的棉蚜校正防治效果在第6 d时即达到峰值，1×108、1×107和1×106孢子/mL试验区的校正防治效果分别为43.75%、39.64%和19.95%（图3B）。球孢白僵菌对棉蚜的剂量效应在1×108和1×107孢子/mL两个试验区间差异不明显，有剂量饱和现象。

图3 自然条件下球孢白僵菌Bb202对棉蚜种群的田间控制作用Fig.3 Field control of A.gossypii population by B.bassiana Bb202 under natural conditions

2.4 环境湿度调控下两种昆虫病原真菌对棉蚜的防治效果

对环境进行湿度调控，即在田间防治后的第2 d和第3 d喷水雾增湿，可以明显提高两种昆虫病原真菌对棉蚜种群的控制作用（图4、图5）。

环境增湿后，玫烟色虫草Ifu13a自第3 d起，1×108、1×107孢子/mL防治区的虫口减退率与空白对照区差异显著；第6 d时，1.0×106孢子/mL防治区的棉蚜虫口减退率急剧上升，开始与空白对照区的虫口减退率差异显著；第8 d比第7 d的虫口减退率稍有增长，此时1.0×108、1.0×107和1.0×106孢子/mL各防治区的棉蚜校正防治效果分别为85.45%、84.63%和50.00%，与自然环境相比，分别提升22.54%、38.27%和22.77%（图4）。

图4 湿度调控下玫烟色虫草Ifu13a对棉蚜种群的田间控制作用Fig.4 Field control of A.gossypii population by C.fumisorosea Ifu13a under humidity regulation

环境湿度调控均可明显降低玫烟色虫草各浓度防治区的半致死时间LT50（本文含义为：田间棉蚜种群减退率达到50%时所需要的时间），3个应用浓度从高到低对应的LT50分别下降了1.26、2.74和2.88 d；同时，半致死剂量LC50（田间棉蚜种群减退率达到50%时所需的真菌应用浓度）也明显降低，从4.86×107孢子/mL下降到9.93×106孢子/mL。结果表明，环境湿度调控明显加快了玫烟色虫草的杀虫速度，提高了玫烟色虫草田间防治的剂量效能（表2）。

表2 湿度调控对玫烟色虫草防治棉蚜效果、半致死时间LT50和半致死浓度LC50的影响Table 2 Impact of humidity regulation on control effect, median lethal times (LT50), and median lethal concentration dosage (LC50) in the field control of A.gossypii by C.fumosorosea Ifu13a

田间的环境湿度调控对球孢白僵菌Bb202菌株防治棉蚜效果的影响同样显著（图5），虽然同样是从第4 d开始，各浓度防治区的虫口减退率与对照区差异显著，但1×108、1×107、1×106孢子/mL防治区的虫口减退率下降更为明显，分别为64.39%、45.78%和16.19%，比自然环境中相同浓度分别高出33.35%、16.66%、5.64%；第8 d时，各防治区的棉蚜校正防治效果分别为75.96%、64.24和12.60%，各防治区间差异显著。环境湿度调控对田间防治效果的影响，显示出一定的剂量效应，田间应用剂量较高，则环境湿度调控的防治效果越好；环境湿度调控下，1×108和 1×107孢子/mL防治区的校正防治效果分别提升了32.49%、22.60%，而1×106孢子/mL防治区与自然防治区相比差异不显著。

图5 湿度调控下球孢白僵菌Bb202对棉蚜种群的田间控制作用Fig.5 Field control of A.gossypii population by B.bassiana Bb202 under humidity regulation

从3个不同应用浓度的半致死时间LT50来看，环境湿度调控可以加快白僵菌对棉蚜的控制速度；1.0×108、1.0×107和1.0×106孢子/mL三个防治区，球孢白僵菌Bb202对棉蚜的LT50比自然条件下分别低了2.95、2.27、1.32d（表3），环境湿度调控作用对较高真菌应用浓度更明显。在进行环境湿度调控后，球孢白僵菌Bb202菌株对棉蚜的LC50从自然条件下的1.17×108降低至3.50×107孢子/mL，表明增加环境湿度可以明显增加菌株对目标害虫的毒力水平。

表3 湿度调控对球孢白僵菌防治棉蚜效果、半致死时间LT50和半致死浓度LC50的影响Table 3 Impact of humidity regulation on control effect, median lethal times (LT50), and median lethal concentration dosage (LC50) in the field control of A.gossypii by B.bassiana Bb202

3 讨论

昆虫病原真菌常被喷洒真菌孢子来防治重要农林害虫，由于每次喷洒时的剂量、次数、环境因子等条件不同，常导致防治效果的差异。利用昆虫病原真菌防治害虫的本质是有效地在害虫种群中诱发真菌流行病，而昆虫病原真菌、寄主害虫与环境因子是流行病发生的三要素。由于在应用昆虫病原真菌防治目标害虫时，病原真菌可以通过生物测定筛选得到高毒力菌株，防治时寄主昆虫的虫龄与虫口密度也较容易人为确定，因此最影响田间实际防治效果的因素是环境因子，包括温湿度、光照、风等，而温度与湿度常被认为是最重要的两个环境因子[21]。

不同昆虫病原真菌由于生物学特性不同，有着不同最适温区，如球孢白僵菌的最适温度范围是22 ℃～28 ℃，而棒束孢是18 ℃～22 ℃，棒束孢是偏低温型流行菌株[22]。在本试验中，两种真菌对棉蚜都有较好的防治效果，但玫烟色虫草Ifu13a菌株在自然和人工湿度调节环境中，对棉蚜的防治效果都要优于球孢白僵菌Bb202菌株，这种差异除了与菌株的毒力水平有关外，可能还与玫烟色虫草属偏低温型流行菌株有关。

对于很多昆虫病原真菌的侵染而言，环境相对湿度可能比温度相更为重要，相对湿度甚至是很多昆虫病原真菌田间防治害虫成功与否的最关键因素。白云等[23]发现环境湿度直接影响到白僵菌的流行病发生过程。田晶等[24]、Ramoska[25]、Narit等[26]在研究玫烟色虫草、球孢白僵菌、绿僵菌的萌发与侵染中，均发现当相对湿度低于75%时，孢子萌发率和目标害虫的死亡率低，而相对湿度越高，越有利于孢子萌发与侵染；昆虫病原真菌对较高的环境湿度需求具有一定的共性。戴君惕[27]甚至认为只有相对湿度高于90%以上时，球孢白僵菌的孢子才能萌发并侵入虫体，环境相对湿度接近 100%时，繁殖菌丝才能突出虫体形成分生孢子。也有玫烟色虫草在75%相对湿度中，对刺吸式口器害虫防治效果良好的报道，这可能与菌株生物学特性及植物叶面的微生境有关[9]。在玫烟色虫草防治棉蚜的田间试验中，曹娜[28]发现降雨往往有利于提高蚜虫的田间防治效果，因为降雨可以阶段性地提高环境相对湿度；而Wang等[29]在利用球孢白僵菌防治松毛虫的田间试验中发现在环境相对湿度较高的春季更容易获得良好的防治效果。本研究通过两种昆虫病原真菌防治棉蚜的田间试验过程中阶段性的田间补湿，显著提升了球孢白僵菌和玫烟色虫草对棉蚜的田间防治效率，进一步证实了环境相对湿度对昆虫病原真菌侵染的重要意义，也证明了环境湿度调控是提升昆虫病原真菌田间防治效果的有效途径。这种环境湿度调控有利于克服湿度过低导致的孢子萌发与侵染障碍，对于提高昆虫病原真菌的害虫田间防治效果具有普遍意义，一般情况下均可应用，但如果田间植物本身某种真菌性病害发生严重，那这种环境湿度调控对可能会加剧植物病害的影响则需要进行认真评估。

从试验数据来看，环境湿度调控对多数田间应用剂量均有显著的防效提升作用，棉蚜死亡速度与死亡率均大幅提升，但如果应用浓度过低则也可能防效提升不显著。同时，在球孢白僵菌和玫烟色虫草对棉蚜的田间试验中，均发现了“剂量饱和”现象，即两种真菌的 1×108和1×107孢子/mL防治区最终的校正防治差异不显著。因此，在防治害虫时，需要恰当选择昆虫病原真菌的田间应用剂量。

昆虫的真菌流行病的发生与否很大程度上决定于昆虫病原真菌、寄主昆虫与环境因子三者的流行病学关系，只有各环节有利于昆虫真菌的侵染与传播时，才可能有效地诱发害虫种群的真菌流行病。本研究表明可以通过环境湿度调控来提高昆虫病原真菌在田间对目标害虫的防治效果。这种环境湿度调控技术尤其适用于相对湿度较低的季节及相对干旱的地区，而田间的环境湿度调控可以通过设施农业装备或直接通过无人机喷雾等技术手段得以实施。这种环境湿度调控的昆虫病原真菌田间应用策略，对昆虫病原真菌的高效利用有着重要的参考意义。