基于聚氨酯海绵载体的棘孢木霉固体发酵培养基筛选

杨小龙，石朝慧，乔 燚，游钟浩，顾 钢，林智慧，周 挺，梁颁捷，陈承亮，刘国坤，肖 顺*

（1.福建农林大学植物保护学院，福州 350002；2.福建省烟草公司烟草科学研究所，福州 350003；3.福建省烟草公司三明市公司，三明 365000）

木霉菌Trichodermaspp.是一类适应性强，生长迅速，分布广泛的真菌[1-5]。木霉菌种类众多，在植物病害生物防治、土壤修复、促进植物生长等方面得到广泛的关注与应用[6]。棘孢木霉T.asperellum是目前国内外研究相对较多的生防菌，其可通过竞争作用、重寄生作用、促生作用、抗生作用等多重生防机制抑制植物病原菌[7]。近年来，大多数木霉菌商业制剂都使用分生孢子作为制剂的有效成分[8]，获得高产量、易收获、低成本的木霉菌分生孢子的研究仍是研究的热点[9]。固态发酵仍是目前被公认为生产木霉菌分生孢子最好的方法[10,11]。

固体发酵又称为固态发酵，根据固态发酵所使用固相的性质，可将固态发酵分为营养载体固体发酵与惰性载体固体发酵[12,13]。营养载体固体发酵虽然历史悠久、成本较低，但也存在过程繁琐、周期较长、易污染、不易收集纯孢粉、底物容易结块导致通气不足等缺点[14,15]，在工业化生产中存在一定的局限性。惰性载体固体发酵是一种新型固体发酵技术，利用惰性载体固体发酵后可以更清洁地获取产物，加之其发酵载体性状稳定，还可以被多次重复利用[16-18]。惰性载体固体发酵木霉菌的研究可能是解决当前木霉菌发酵工艺中存在局限性问题的一种有效途径。

聚氨酯海绵Polyurethane Sponges具有较规律的孔隙排列、稳定的物理结构及较好的持水率，可为真菌发酵提供良好的通气和散热途径。近几年，惰性载体固体发酵研究比较广泛，展现出较好的发展前景，但主要集中于活性物质的生产[19-21]，Hu等[22]利用聚氨酯海绵固态发酵生产纤维素酶，酶产率显著高于不使用惰性载体的对照。但是对于惰性载体固体发酵生产真菌分生孢子的文章鲜有报道。

本实验室在前期研究发现，棘孢木霉菌THGY-01可在吸有液体培养基的聚氨酯海绵惰性载体上生长良好并产孢，由于培养基的组成是直接影响发酵代谢产物和孢子产量最重要的影响因素之一[23]，所以对培养基的筛选和优化是聚氨酯海绵惰性载体发酵的一个基础性研究。

因此，本研究以棘孢木霉THGY-01为试验菌株，以单位质量聚氨酯海绵载体产孢量为指标，筛选产孢最佳的培养基配方，为发酵条件优化和发酵工艺构建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：棘孢木霉Trichodermaasperellum（CGMCC No：22422）THGY-01，由本实验室保藏（从食用菌栽培培养获得）。

供试载体：聚氨酯海绵（购买自瑞安市方圆聚氨酯有限公司，ρ＝28 kg/m3，孔径：30 ppi（约0.4～0.6 mm），前期试验筛选确定使用该密度与孔径大小）。

供试培养液：基础培养液（Ⅰ）：蛋白胨2.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO43.0 g；基础培养液（Ⅱ）：葡萄糖20.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO43.0 g；基础培养液（Ⅲ）：葡萄糖20.0 g，蛋白胨2.5 g；基础培养液（Ⅳ）：葡萄糖20.0 g，蛋白胨2.5 g，KH2PO43.0 g；各物质溶解后，均定容至1000 mL，分装至500 mL的锥形瓶内（装量为250 mL/瓶），1.01×105Pa，121 ℃高压湿热灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液的制备 用无菌水将培养6～7 d的木霉菌斜面配制成浓度为1.0×107孢子/mL的孢子悬浮液，按4%（V/V）的比例接种至不同培养液中，恒温振荡（28 ℃、150 r/min）培养24 h制成种子液。

1.2.2 接种与发酵 将洗净的聚氨酯海绵于电热鼓风干燥箱 100 ℃条件下烘干，用纸包好于 121 ℃高压湿热灭菌30 min，备用。按载体与种子液固液比1:10（M/V，每块持液量为8 mL），将种子液倒入盛有无菌聚氨酯海绵载体（长10 cm×宽3 cm×高1 cm）的无菌浅盘中，用无菌玻璃涂布器均匀挤压海绵，让所有种子液被载体充分吸收。将接种后的聚氨酯海绵载体放入无菌发酵盘（长35 cm×宽25 cm×高10 cm）内，于25 ℃发酵室内恒温培养，发酵盘用透气的Parafilm封口膜封口。

1.2.3 载体产孢量的测定 分别于培养的第3、4、5、6和7 d测定载体产孢量。每个处理随机取3块聚氨酯海绵载体，用一定量的0.15%吐温-80（V/V）充分清洗载体至载体表面无明显木霉培养物。用血球计数板计数并计算产孢量。

1.2.4 单因素试验设计 碳源的筛选[24]：选取11种碳源，分两批次进行。第一批6种碳源：葡萄糖、蔗糖、甘露醇、果糖、可溶性淀粉、甘油，第二批5种碳源：麦芽糖、海藻糖、糖蜜、木糖、乳糖。所有碳源均以2.0%（M/V）的用量分别添加至基础培养基（Ⅰ）中，设无添加碳源的培养基为对照，每处理3次重复。

氮源的筛选[25]：分别以酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、NH4NO3、NH4Cl和尿素为氮源，以0.25%（M/V）用量分别添加至基础培养基（Ⅱ）中，设无添加氮源的培养基为对照，每处理3次重复。

无机盐的筛选：分别以 MgSO4·7H2O、Na2SO4、KCl、CaCl2、KH2PO4、NH4H2PO4、NaNO3和 KNO3为大量元素，以0.2%（M/V）用量分别添加至基础培养液（Ⅲ）中，设无添加无机盐的培养液为对照，每处理3次重复。

对筛选出的碳源、氮源以及无机盐进行浓度优化，选取基础培养液（Ⅰ），分别添加浓度为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%（M/V）蔗糖和糖蜜；选取基础培养液（Ⅱ），分别添加浓度为0.1%、0.2%、0.4%、0.8%和1.6%（M/V）的酵母粉；选择基础培养液（Ⅲ），分别添加浓度为0.05%、0.10%、0.20%、0.40%和0.80%（M/V）的KH2PO4，每处理3次重复。

1.2.5 不同微量元素对产孢的影响 选用 FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、H3BO3和Na2MoO4·2H2O分别测定其对产孢的影响，以0.2%（M/V）的用量分别添加至基础培养液（Ⅳ）中，设无添加微量元素的培养液为对照，每处理3次重复。

1.3 数据统计与分析

运用Microsoft Excel-2016、IBM SPSS Statistics-22.0软件进行数据处理和分析（Duncan’ s法方差分析）。

2 结果与分析

2.1 碳源的筛选与优化

2.1.1 碳源种类的选择 第一批碳源筛选试验结果表明，发酵第3 d时，供试的6种碳源中，可溶性淀粉的处理产孢量最高，达5.60×108孢子/g，与其他处理差异显著；发酵第5 d时，蔗糖的处理产孢量最高，达10.79×108孢子/g，与其他处理差异显著；发酵至7 d时，葡萄糖与蔗糖处理的产孢量均较高，分别达到10.93×108和10.43×108孢子/g，与其他处理产孢量差异显著；可溶性淀粉处理的产孢量最低，仅为7.03×108孢子/g（表1）。

表1 不同碳源对木霉菌惰性载体产孢的影响（第一批）Table 1 The influence of different carbon sources on the sporulation of Trichoderma by inert carrier (first batch)

第二批碳源筛选试验结果表明，发酵第5～7 d时，麦芽糖与糖蜜是5种供试碳源中产孢量最高的处理；发酵第7 d时，产孢量分别达到18.51×108和16.90×108孢子/g，与其他处理的产孢量差异显著（表2）。

表2 不同碳源对木霉菌惰性载体产孢的影响（第二批）Table 2 The effect of different carbon sources on the sporulation of Trichoderma by inert carriers (second batch)

综合产孢量（表1，2）和碳源成本等因素，选择蔗糖（双糖）、糖蜜（副产物）为进一步试验的供试碳源，继续探究其不同浓度对菌株THGY-01在聚氨酯海绵载体发酵产孢的影响。

2.1.2 两种碳源浓度的确定 不同浓度的蔗糖对木霉菌在聚氨酯海绵上产孢结果表明，发酵第7 d时，不同浓度处理组中2.0%（M/V）处理的产孢量最大，达到15.81×108孢子/g，高浓度的蔗糖反而不利于其产孢（表3）；不同浓度的糖蜜对产孢的影响试验结果表明，高浓度的糖蜜有利于木霉菌的产孢，发酵第6 d时，5.0%（V/V）处理的产孢量最高，达 49.23×108孢子/g，与其他处理组差异显著，是蔗糖处理最高产孢量的2.99倍（表4）。综合2种碳源不同浓度的产孢量及成本等因素，确定糖蜜为菌株THGY-01在聚氨酯海绵载体发酵产孢的碳源，并继续对其浓度进行优化。

表3 蔗糖浓度对木霉菌惰性载体产孢的影响Table 3 The influence of sucrose concentration on the sporulation of Trichoderma by the inert carrier

表4 糖蜜浓度对木霉菌惰性载体产孢的影响Table 4 The influence of molasses concentration on the sporulation of Trichoderma by the inert carrier

2.1.3 糖蜜浓度的选择 对糖蜜的浓度进行优化试验结果表明，发酵第5 d时，10.0%（V/V）处理的产孢量最高，达9.15×109孢子/g，与其他处理组差异显著；发酵第8和10 d时，30.0%（V/V）处理的产孢量最高，产孢量达到18.86×109和16.78×109孢子/g，与其他处理组差异显著；随着糖蜜浓度的增加，产孢量变大，浓度达到 40.0%（V/V）时，产孢量变小，发酵周期也延长，因此选择糖蜜的使用浓度为 30.0%（V/V）（图1，表5）。

表5 糖蜜浓度对木霉菌惰性载体产孢的影响Table 5 The influence of molasses concentration on the sporulation of Trichoderma by the inert carrier

图1 木霉菌在不同浓度糖蜜处理聚氨酯海绵上的产孢情况Fig.1 Sporulation of Trichoderma on polyurethane sponge with different molasses concentration treatments

2.2 氮源的筛选与优化

2.2.1 氮源种类的选择 试验结果（表6）表明，在发酵的第6、7 d时，酵母粉和牛肉浸膏处理的产孢量均较高，其中发酵7 d时产孢量分别达10.87×108和11.88×108孢子/g，与其他处理差异显著；氮源为氯化铵和尿素处理的产孢量较低，其产孢量分别为3.02×108和1.60×108孢子/g。综合产孢量、成本与使用方便性，选择酵母粉为菌株THGY-01聚氨酯海绵载体发酵产孢的氮源，并继续进行浓度筛选试验。

表6 不同氮源对木霉菌惰性载体产孢的影响Table 6 The effect of different nitrogen sources on the spore production of Trichoderma by inert carrier

2.2.2 氮源浓度的筛选 不同浓度的酵母粉对产孢的影响试验结果（表7）表明，发酵第6 d时，浓度为0.2%、0.4%、0.8%（M/V）处理的产孢量较高，产孢量分别达到11.98×108、14.16×108和11.65×108孢子/g，与其他处理差异显著；发酵第7 d时，浓度为0.4%（M/V）处理的产孢量最高，达15.46×108孢子/g；1.6%（M/V）处理的产孢量最低，产孢量仅为0.63×108孢子/g。综合考虑，确定酵母粉的添加量为0.4%（M/V）。

表7 酵母粉浓度对木霉菌惰性载体产孢的影响Table 7 The effect of yeast concentration on sporulation of Trichoderma by inert carrier

2.3 无机盐的筛选与优化

2.3.1 无机盐种类的选择 不同无机盐对木霉菌惰性载体产孢影响的试验结果（表 8）表明，在发酵的不同时间，KH2PO4处理的产孢量均高于其他处理；发酵第6 d时，产孢量达到21.03×108孢子/g，与其他处理的差异显著；含钾元素的3个处理的产孢量在发酵的3～7 d中产孢量均高于其他处理，其他不含钾元素的5个处理的产孢量较低，与CK无显著性差异。含钾离子的无机盐添加有利于木霉菌的生长与产孢。根据试验结果，选择KH2PO4为菌株THGY-01聚氨酯海绵载体发酵产孢的无机盐，并继续进行浓度筛选试验。

表8 不同无机盐对木霉菌惰性载体产孢的影响Table 8 The effect of different inorganic salt on the spore production of Trichoderma by inert carrier

2.3.2 KH2PO4浓度的筛选 试验结果表明，不同浓度KH2PO4的添加对木霉菌聚氨酯海绵产孢均有影响，添加一定浓度的KH2PO4有利于其产孢。发酵6 d时，浓度为0.20%（M/V）处理的产孢量最高，达23.09×108孢子/g，与其他处理差异显著；0.80%（M/V）处理的产孢量最低，仅为 13.18×108孢子/g。因此，确定KH2PO4的添加浓度为0.2%（M/V）（表9）。

表9 不同KH2PO4浓度对木霉惰性载体产孢的影响Table 9 The influence of different KH2PO4 concentration on the sporulation of Trichoderma by inert carrier

2.4 微量元素对产孢的影响

微量元素对产孢影响的试验结果表明，发酵6 d时，添加Cu、Zn和Mn元素处理的产孢量较高，分别达到9.83×108、11.87×108和12.06×108孢子/g，与CK差异显著。向培养基中添加一定种类适当浓度的Cu、Zn和Mn元素对木霉菌聚氨酯海绵载体发酵的产孢有促进作用（图2）。

3 讨论

惰性载体固体发酵是在浸渍了少量液体培养基的惰性载体上培养微生物来完成发酵的过程[26]。惰性载体固体发酵避免了营养载体固体发酵板结和坍塌的缺陷，有利于供氧和维持较好的水动力学特性[15]。俞云峰等[27]研究表明与标准品麦麸营养载体固体发酵产生的孢子相比，惰性载体固体发酵产生的孢子致病力符合商品化孢子的要求。

聚氨酯海绵材料相对稳定的孔隙和良好的毛细作用非常适宜水分的聚集和液膜的形成[28]，因此近年来被一些工业微生物学家们所关注。目前大多数研究是在聚氨酯海绵载体材料中加入一定量的液体培养基后进行发酵，可为真菌发酵提供良好的生长和散热途径。试验中通过扫描电子显微镜（SEM）观察发现，发酵后聚氨酯海绵的物理结构未发生明显变化，载体中的菌体生长良好，表明聚氨酯海绵是生防菌发酵中非常实用的一种载体。虽然有学者曾经提出，惰性载体吸附液体培养基也有可能在载体内部形成微小的液态环境，在其内部生长的菌体有可能会以液态发酵的方式生长，从而产生活力、萌发能力均不理想的芽生孢子，但俞云峰等[27]通过扫描电镜直观地找出相应的证据，证明微小液态发酵的可能性不存在。前期研究发现，棘孢木霉菌在浸有液体培养基的聚氨酯海绵惰性载体上生长良好并能产孢，由于培养基的配比与组成是发酵工艺中最重要的基础性工作[29]，人们很重视对发酵中的碳源、氮源及大量和微量元素的筛选。

在惰性载体固体发酵的研究中，人们通常使用容易被微生物利用的葡萄糖、蔗糖等碳源。吴娜等[30]研究发现，蔗糖和葡萄糖有利于棘孢木霉在平板中的生长与产孢。工业发酵中若利用葡萄糖与蔗糖，则碳源的成本约占生防孢子剂总成本的一半[29]。糖蜜是产糖工业的副产物，含糖量高、价格便宜，可以作为良好的碳源，其主要成分除糖类外，还含有其他微量元素与生长因子[31]。研究发现，糖蜜是木霉菌株THGY-01聚氨酯海绵载体固体发酵中产孢较好的碳源，且添加量越多越有利于产孢，但发酵周期也越长。发酵第8 d时，30.0%（V/V）处理的产孢量可达18.86×109孢子/g。

氮源常分为无机氮源和有机氮源[32]。有机氮源含有丰富的氨基酸、维生素及生长因子等营养物质，包括蛋白胨、玉米浆和各种有机粉饼等物质，倍受人们重视。无机氮源是微生物生长的速效氮源[33]，包括各种铵盐、硝酸盐和氨水等[34]。本研究选用酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、NH4NO3、NH4Cl、尿素为氮源进行试验，筛选出酵母粉为最佳的产孢氮源，最适浓度为0.4%（M/V）。酵母粉与牛肉浸膏是利于菌体吸收、促进菌体生长且为较常见的有机氮源，但相比之下，酵母粉的价格更便宜，来源更方便，故选择酵母粉为菌株THGY-01在聚氨酯海绵上固体发酵的氮源。

本研究发现添加质量分数为0.2%（M/V）的KH2PO4可显著提高孢子产量。但董海燕等[35]以米糠、麸皮为主要培养基的棘孢木霉固体发酵中研究表明，钾离子对棘孢木霉的产孢有明显的抑制作用。其可能是因为发酵模式与主要营养物质不同时，木霉对大量元素的需求不一样，具体原因还有待于进一步研究。