一株猪源葡萄球菌的分离鉴定与耐药性分析

张爱琼 ，黎娜铭 ，黄 书 ，张宇鑫 ，吴 艳 ，吴学祥

（1.毕节市动物疫病预防控制中心，贵州 毕节 551700；2.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州省独山县麻尾镇人民政府，贵州 独山 558206）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是一种无芽胞、无鞭毛的革兰氏阳性菌，显微镜下似葡萄串状，直径0.5~1.5 μm，适宜在普通培养基和血琼脂培养基上生长，在麦康凯平板培养基上几乎不能繁殖。该菌广泛存在于大气环境、饲料、食物、水源、场地以及物体表面，对人和畜禽具有一定的致病性，可引发受伤感染、化脓病症、肠内炎症、败血症及毒素作用，可存在于畜禽的表皮、黏膜、大肠、鼻腔及气管，甚至是乳腺中。近年来，金黄色葡萄球菌耐甲氧西林分离株的逐渐增加，耐药性发生变异，临床用药变得复杂化，给临床猪只疫病防治带来了很大的困难，造成了较大的经济损失。对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定以及耐药性分析具有非常重要的意义，本试验旨在为金黄色葡萄球菌病原的实验室诊断和相关疾病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料组织

无菌采集的贵阳市花溪区农贸市场附近某养殖户病猪的喉、气管、肺脏等组织样品。

1.2 主要试剂

革兰氏染色液试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司（Solarbio）；Taq PCR MasterMix for PAGE，购自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；抗菌药物药敏纸片，购自杭州驰成医药科技有限公司；细菌微量生化反应管，购自南京全隆生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 PCR扩增引物

细菌16S通用引物（预扩增 片 段 1 481bp） F：5’-AGA GTTTGATCATGGCTCA G-3’，R ：5’-TACGGTTACCTT GTTACGACTT-3’。

1.4 细菌的培养

无菌条件下，用接种环取少量的猪喉、气管、肺等组织接种于普通琼脂平板，置于37℃恒温培养箱中培养18~24 h，无菌挑取单个完整的菌落，接种于普通肉汤培养基，进行纯化培养得到纯培养物。

1.5 光学显微镜鉴定

将单个菌落培养得到的菌液进行涂片、固定、结晶紫初染、碘液媒染、酒精脱色、番红复染后自然干燥晾干，随后将革兰氏染色得到的涂片置显微镜下观察，并拍照记录结果。

1.6 生化鉴定

在无菌条件下，用接种环挑取分离纯化的细菌接种于生化反应管中。为了保证反应的效果与准确性，接种环要深入生化管底部反复抽动几次以使菌液能混匀整个生化管。用封口胶将反应管严密封口，置于37℃恒温恒湿箱中培养23 h，观察并记录各管的试验结果。

1.7 PCR检测鉴定

将培养的细菌样品利用水煮法提取核酸，用细菌16S（F/R）通用引物进行PCR扩增，反应总体系（15.0 µL）：Taq PCR MasterMix 酶7.5 μL，上、下游引物各 0.5 µL，核 酸 模 板 1.0 µL，ddH2O 5.5 µL。反应程序为：94℃ 5 min；94℃1 min，57℃ 40 s，72℃ 2 min，38 个循环；72℃延伸10 min。扩增结束后取出产物，经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪中观察，并拍照记录。

1.8 PCR产物的测序与遗传进化分析

将PCR扩增得到的目的条带DNA纯化后，送至生工生物有限公司进行测序。经拼接后，运用DNAStar程序和MEGA5软件进行相似性和遗传进化分析。

1.9 药敏试验

吸取1 mL菌液于均匀涂布在培养皿的普通培养基上，待培养基中的菌液风干后，用镊子夹取药敏纸片置于培养基中，轻轻按压纸片，以同样操作在培养皿四周等距离贴上药敏纸片。药敏纸片的排布方式为正中央1个，边缘等距离贴5个，每个培养皿设布6个药敏纸片，共用5个培养皿测试细菌对30种药物的敏感性。将药片贴好后做标记，置于37°C恒温培养箱中培养23 h，观察并测量各抑菌圈的直径，记录结果。

2 结果与分析

2.1 猪源金黄色葡萄球菌培养结果

经在普通培养基上培养得到单个的菌落，呈圆形，中等大小，直径约为0.8~1.0 μm。颜色为不透明，呈乳白色到金黄色之间。菌落边缘整齐，表面光滑、湿润、稍隆起。挑取单个菌落培养在LB液体培养基中，呈现均匀浑浊现象。

2.2 革兰氏染色镜检结果

挑取单个菌落经革兰氏染色观察，结果显示该菌紫色球菌，大部分呈葡萄串状排列，少许为单个、成双或链状排列，如图1所示。

图1 革兰氏染色镜检结果

2.3 生化试验结果

挑取培养菌接种于10种生化反应管，在恒温箱（37℃）中培养24 h后，结果如表1所示，分离菌株可以分解乳糖、覃糖、血清菊糖及甘露醇，不能分解棉子糖，对七叶苷、山梨醇、马尿酸钠、水杨素与6.5%Na肉汤反应为阴性。

表1 分离菌株生化试验结果

2.4 PCR扩增结果

2.4.1 分离菌PCR扩增结果

用细菌16S引物对提取的细菌核酸进行PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，扩增得到约1 500 bp左右的基因片段。

图2 分离菌凝胶电泳检测结果

2.4.2 金黄色葡萄球菌B10S1912180611Q株的同源性分析

将测序得到的序列进行拼接后命名为B10S1912180611Q株，运用DNAStar程序将其与GenBank中收录胸膜肺炎放线杆菌（NR044752）、副猪嗜血杆菌（AB078972）、巴氏杆菌（NR118747）、多杀巴斯德氏菌（NR115137）、链球菌（NR037096）、葡萄球菌（MW282888）等15株参考株进行比较发现，其与金黄色葡萄球菌S.aureus LZS-003（MW282888）、S.aureus ATCC 12600（NR115606）和S.aureus NBRC 100910（NR113956）菌株相似性最高为100%，与链球菌（NR037096）相似性最低为75.1%（如图3所示）。

图3 B10S1912180611Q株相似性分析

运 用MEGA5软 件 将B10S1912180611Q株与15株参考菌株进行遗传进化分析，发现其与金黄色葡萄球菌S.，aureus LZS-003（MW282888）、S.aureus ATCC 12600（NR115606）和 S.aureus NBRC 100910（NR113956）菌株同源性最高为100%处于同一进化细分支，遗传关系最近，与链球菌（NR037096）处于不同的进化大分支，遗传关系最远（如图4所示）。

图4 B10S1912180611Q株遗传进化分析

2.5 药敏试验结果

将纯化培养后的菌液进行药敏试验，经23 h培养后各药敏纸片出现大小不一抑菌圈，记录结果（如表2所示），参考M100抗微生物药物敏感性试验执行标准（CLSI）2020版，以抑菌圈的直径大小进行结果判定，发现该分离菌株对青霉素G、氨苄西林、氯霉素、多西环素、克林霉素及痢特灵等药物完全耐药，对氨基糖苷类、四环素等药物也有耐药性，对部分头孢及人工青霉素较为敏感，对麦迪霉素表现为高度敏感。

表2 分离菌株药敏试验结果

3 讨论

金黄色葡萄球菌是一种人兽共患的致病菌，哺乳期仔猪常因皮肤破损而感染该菌，导致皮肤愈合不良，有部分产毒素和致病因素的金黄色葡萄球菌，在动物感染后会导致败血症、创伤愈合不全、肠内炎症和休克综合征等。有研究表明金黄色葡萄球菌对大环内脂类抗生素、β-内酰胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环素抗生素有一定的耐药性，在临床上猪只感染该病原菌，用药防治方面药敏试验显得非常重要。本次试验通过病猪的组织样品进行细菌分离培养后，得到的表面光滑、湿润、微隆、大小中等的单一菌落，边缘整齐。对该细菌进行纯化培养后革兰氏染色鉴定，发现该菌在光学显微镜下呈现蓝紫色似葡萄串状排列的球菌，少许为单、双个或链状排列。生化鉴定试验中，该菌株可以分解乳糖、覃糖、血清菊糖及甘露醇，不能分解棉子糖，对七叶苷、山梨醇、马尿酸钠、水杨素与6.5%Na肉汤反应为阴性。本试验分离鉴定得到的细菌生长特性及生化鉴定结果符合金黄色葡萄球菌特性，初步确定该猪可能感染了金黄色葡萄球菌。同时，用细菌16S通用引物扩增得到1 394 bp基因序列，将其与Genbank收录的15株细菌参考基因序列进行相似性和遗传进化分析，发现分离菌株B10S1912180611Q与金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus LZS-003、Staphylococcus aureus ATCC 12600、Staphylococcus aureus NBRC 100910等菌株相似性最高为100%，且遗传进化处于同一分支，进一步实验表明分离菌株为金黄色葡萄球菌。

在分离鉴定后对该株金黄色葡萄球菌进行30种药片的药敏试验，发现该菌株对青霉素G、氨苄青霉素、氯霉素、多西环素、氯洁霉素（克林霉素）、痢特灵（硝基呋喃类）、万古霉素的抑菌圈直径为0，表示该菌株对部分青霉素类（青霉素G、氨苄西林）、广谱类药物（氯霉素、多西环素、克林霉素等）及硝基呋喃等药物完全耐药，甚至对万古霉素也已经不敏感了。其对氨基糖苷类、四环素等药物基本具有耐药性，对新霉素、庆大霉素两种药物中度敏感，而对阿米卡星、四环素及卡那霉素等药物表现耐药；对部分头孢及人工合成的青霉素较为敏感，对麦迪霉素表现高度敏感。在临床感染金黄色葡萄球菌的病猪，可先考虑麦迪霉素、头孢及人工青霉素，如头孢呋新、头孢三嗪（菌必治）、卡比西林等，也可用环丙沙星、庆大霉素等中度敏感的药物进行治疗。有研究报道，治疗金黄色葡萄球菌感染时，选用庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星、复方磺胺等抗菌药效果较好，通过选择庆大霉素、环丙沙星进行治疗得到了良好效果，这与本试验的选药建议基本符合。关于金黄色葡萄球菌耐药性的变异及传播，有研究证明这可能与来源于人类和不同动物的金黄色葡萄球菌tet（M）基因有关。