基于农艺性状和ISSR标记的秀珍菇遗传多样性分析

宋吉玲 王伟科 陆娜 闫静 袁卫东 巫优良

摘要：【目的】分析評价秀珍菇菌株的农艺性状与遗传多样性，为秀珍菇种质资源分类鉴定、遗传育种等提供理论参考。【方法】通过ISSR分子标记技术对10个秀珍菇菌株进行PCR产物扩增电泳检测，以ISSR聚类图谱分析不同菌株间的亲缘关系;对各菌株开展品比试验，观测各菌株的菌丝生长、子实体农艺性状和产量等农艺性状，并对其进行综合分析。【结果】聚类分析结果表明，10个秀珍菇菌株遗传相似水平为0.47～0.92，在0.69水平上可分为4个类群;依据农艺性状的遗传多样性分析表明，各性状的遗传多样性指数变化幅度为0.496～1.828，变异系数为7.76%～25.21%，存在着丰富的遗传多样性。Pearson相关分析发现，秀珍菇菌株的产量与菌丝生长速度呈极显著正相关（P<0.01，下同），而菌盖宽度与菌盖厚度、菌柄直径呈显著正相关（P<0.05），菌盖厚度与菌柄直径呈极显著正相关。主成分分析表明，4个主成分的特征值均大于1，累积贡献率为84.891%，主成分为菌柄直径、菌盖厚度、产量、菌盖颜色和黄菇病，能较好地解释所有变量包含的全部遗传信息。【结论】依据菌株农艺性状与分子标记分析结果，台秀1号、秀珍菇12和中农秀珍菇菌株可作为品种选育的亲本使用，其中秀珍菇12和中农秀珍菇菌株各项农艺性状均表现较好，可在浙江地区进行推广栽培。

关键词： 秀珍菇;农艺性状;ISSR分子标记;遗传多样性分析

中图分类号： S646.9                                 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）01-0173-09

Genetic diversity analysis of Pleurotus pulmonarius（Fr.） Quél.based on agronomic characters and ISSR markers

SONG Ji-ling1， WANG Wei-ke1， LU Na1，YAN Jing1， YUAN Wei-dong1， WU You-liang2*

（1Hangzhou Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou  310024， China; 2Jiangshan Characteristic Planting

Technology Promotion Center， Jiangshan， Zhejiang  324104， China）

Abstract：【Objective】The agronomic characters and genetic diversity of Pleurotus geesteranus（Fr.） Quél.strains were analyzed and evaluated， to provide theoretical reference for classification and identification of P. geesteranus germplasm resources and genetic breeding. 【Method】 PCR products of 10 P. geesteranus strains were detected by ISSR mole-cular marker technology， and the genetic relationship among different strains was analyzed by ISSR cluster map. Comparative experiments were carried out on each strain， and the agronomic characters such as mycelium growth， fruiting body agronomic characters and yield of each strain were observed and comprehensively analyzed. 【Result】The results of cluster analysis showed that the genetic similarity of 10 P. geesteranus strains ranged from 0.47 to 0.92， which could be divided into 4 groups at 0.69 level. According to the analysis of the genetic diversity of agronomic characters， the variation range of the genetic diversity index of each character was 0.496-1.828， and the coefficient of variation was 7.76%-25.21%， which showed that there was abundant genetic diversity. Pearson correlation analysis showed that the yield of P. geesteranus was extremely significantly positively correlated with the growth rate of hypha（P<0.01，the same below）， while the width of the cap was significantly positively correlated with the thickness of the cap and the diameter of the stipe（P<0.05）， and the thickness of the cap was extremely significantly positively correlated with the diameter of the stipe. Principal component analysis showed that the characteristic values of the four principal components were all greater than 1， and the cumulative contribution rate was 84.891%. The principal components were stalk diameter， cap thickness， yield， cap color and yellow mushroom disease， which could well explain all genetic information contained in all variables. 【Conclusion】According to the analysis results of agronomic characters and molecular markers of all strains， the strains of Taixiu 1，Xiuzhengu 12 and Zhongnongxiuzhengu could be used as parents for variety breeding， among which Xiuzhengu 12 and Zhongnong Xiuzhengu have good agronomic characters and can be popularized and cultivated in Zhejiang.

Key words： Pleurotus pulmonarius（Fr.） Quél.; agronomic characters; ISSR molecular marker; genetic diversity analysis

Foundation items： Project of Collaborative Extension of Major Agricultural Technologies of Zhejiang（2021XTTGSYJ01-1）

0 引言

【研究意义】秀珍菇[Pleurotus pulmonarius（Fr.） Quél.]为隶属于担子菌门、伞菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属的大型真菌，又名袖珍菇、环柄侧耳、黄白侧耳和小平菇（戴玉成等，2010）。菇形优美，口感滑嫩，味道鲜美，营养丰富，富含蛋白质、氨基酸及人体必需微量和矿质元素等（陆娜等，2018），具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗突变和提高人体免疫力等多种功效（杨润亚等，2012;Wang et al，2012;陈青等，2016;刘凌云等，2020），深受广大消费者的青睐。近年来，秀珍菇作为浙江省消费者最喜爱的珍稀食用菌之一，发展势头迅猛，至2017年全省栽培规模已达2亿袋，其中杭州市栽培规模也已超过2000万袋，成为推动农民增收的重要手段和农村经济发展的新亮点（陆娜等，2018）。随着秀珍菇栽培规模的不断壮大，栽培模式逐渐由传统的春秋季栽培逐渐向栽培效率和效益更高的夏季设施转换，但与之相配套使用的品种却较少，仍以引自福建罗源的台秀菌株为主（陆娜等，2018;闫静等，2018）。而在生产过程中，台秀菌株常常会出现菌盖颜色偏淡、吐黄水、软袋、烂袋和污染等问题，污染程度高的甚至造成绝产，给生产企业带来巨大的经济损失，也严重制约了秀珍菇产业健康持续的发展。因此，筛选出适宜夏季高温季节使用的优质种源，是实现秀珍菇高产、稳产和优质的重要一环，成为当前急需解决的首要问题。【前人研究进展】关于秀珍菇品种筛选与评价方面的研究报道较多。黄良水等（2011）通过对引进于罗源的15个秀珍菇菌株进行筛选，最终获得适合当地生产的优质、抗逆、高产的秀珍菇菌株青秀2号。王灿琴等（2015）通过对菌丝生长速度、长势、抗逆性、商品性和生物学转化率等方面综合分析，筛选出适宜在桂南地区栽培推广的5个抗逆性和商品性均表现良好的秀珍菇菌株。张俊玲等（2015）以秀珍菇菌株3108为亲本进行自交，通过对子代各性状进行综合分析，从中筛选出菌丝生长快、产量高、菇形佳且抗逆性强的秀珍菇优良新菌株申秀1号。由此可见，在秀珍菇品种选育方面，研究者多以菌丝生长情况、产量和子实体性状等方面进行评价，而从出菇性状、农艺性状评价指标筛选和遗传多样性方面评价的较少。通过ISSR分子标记技术对食用菌遗传差异方面的研究报道较多，马志刚等（2006）通过ISSR标记对侧耳属菌株进行分类研究，结果表明22个菌株在相似系数在0.71时，聚为5类群，同时将同种异名和同名异种的菌株很好地区分开来。冯伟林等（2014）运用ISSR分子标记技术对来源于全国的15个秀珍菇菌株进行遗传差异分析，发现在相似系数为0.87时聚为3个类群，遗传背景差异较大，亲缘关系较远，进一步说明ISSR标记可作为鉴定栽培菌株与已经确定种名菌株间亲缘关系的重要工具。【本研究切入点】国内有关秀珍菇品种筛选与选育的研究相对较多，但是针对夏季高温季节栽培种质资源评价及遗传多样性分析的报道较少。同时，在种质资筛选方面多数是以产量为评价的指标，其他的农艺性状指标较少涉及。因此，需进一步对秀珍菇农艺性状及遗传多样性进行综合评价与分析。【拟解决的关键问题】对引进的10个秀珍菇菌株的农艺性状及遗传差异进行综合分析，以期筛选出适合夏季设施栽培和满足当地市场需求的优质种质，为今后的秀珍菇栽培与育种提供依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为10株收集于各地的秀珍菇菌株，具体名称与来源见表1，其中对照菌株台秀57-66为杭州地区主栽品种。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 试验地概况 于2020年5—10月对收集的秀珍菇品种开展栽培试验，在杭州临安鼎新农业科技有限公司（北纬119°37′44.4″，东经30°12′）进行。当地属季风型气候，平均气温13～22 ℃，温暖湿润，光照充足，雨量充沛，四季分明。年均降水量1613.9 mm，降水日158 d，无霜期年平均为237 d。试验基地年生产规模达120万袋，常年从事秀珍菇生产、栽培，具有丰富的栽培经验。

1. 2. 2 培養基及培养方法 （1）母种培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉13.5 g，蒸馏水1 L。（2）原种培养基：棉籽壳30%，木屑50%，麸皮18%，石灰1%，石膏1%，含水量为55%～60%。（3）栽培种培养基：棉籽壳40%，木屑40%，麸皮18%，石灰1%，石膏1%，含水量约为60%。采用17 cm×38 cm×0.05 mm的聚乙烯栽培袋，按常规方法栽培。每袋装干料0.7 kg，每个重复50袋，设3次重复，测量并记录以下农艺性状：菌盖颜色，黄菇病发生情况，吐黄水情况，整齐度。对菌丝生长速度、菌盖厚度、菌盖长度、菌盖宽度、菌柄直径、菌柄长度和产量进行方差分析。

1. 2. 3 DNA提取 将供试菌株在PDA平板培养基上，于22 ℃培养5 d，连续活化3代，选用菌丝生长旺盛的菌种，取5个1 cm的菌块接种于装有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，22 ℃、140 r/min条件下震荡培养7 d，收集菌丝，使用无菌水漂洗2次，无菌滤纸吸干水分，参照新型快速植物基因组DNA提取试剂（BioTeke，北京）的说明提取DNA。提取后的DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度，并于 -20 ℃保存备用（宋吉玲等，2021）。

1. 2. 4 ISSR引物筛选 从美国哥伦比亚大学（UBC）公布的100条ISSR通用引物中筛选出多态性高、扩增条带清晰、重复性好的10条ISSR引物（表2），委托杭州擎科生物公司合成。

1. 2. 5 ISSR多态性分析 ISSR-PCR扩增体系：2×TSINGKE PCR Master（blue）预混体系10 μL，ISSR引物1 μL，DNA模板（20 ng/μL）3 μL，加ddH2O补齐至20 μL。ISSR-PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，适当退火温度（视引物而定）（表2）30 s，72 ℃ 90 s，进行35个循环;72 ℃ 7 min，16 ℃保存。PCR扩增后的产物用1.5%的琼脂糖凝胶（EB染色）电泳，150 V电泳30 min。采用Chemi Doc XRS ima-ging system（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）对扩增图谱进行拍照，依据平均连锁法UPGMA对ISSR统计形成的“0/1”表型数据进行聚类分析，得出聚类图谱。

1. 3 统计分析

利用SPSS 19.0对试验数据进行主成分分析、单因素方差分析（ANOVA）和LSD检验，计算试验数据的总体平均数（X）、标准差（SD）和变异系数。依据总体平均数计算结果将所有材料划分为10个等级，从第1级[Xi<（X-2s）]到第10级[Xi>（X+2s）]，每0.5s为1级。

多样性指数（Shannon-Weiner Index，H'）的计算公式：

H'=-∑Pi×LnPi

式中，Pi为某性状第i级别内材料份数（ni）占总份数（N）的百分比，即Pi=ni/N。

采用Pearson相关分析法分析菌丝生长情况、子实体农艺性状与产量间的相关性（兰玉菲等，2014）。

2 结果与分析

2. 1 10个秀珍菇菌株的多态性分析

经初筛，从100个ISSR引物中筛选出10个多态性的ISSR引物，对10个秀珍菇菌株的基因组DNA进行ISSR扩增，共扩增出57条较为清晰的DNA条带（图1），片段大小在250～2000 bp。

由图2可看出，10株秀珍菇菌株遗传系数为0.47～0.92，在相似系数为0.47时，可分为2个类群，在相似系数为0.69时，可分为4个类群。秀76、秀珍菇12、秀57、秀大和台秀57-66聚为一类群，其中，秀珍菇12与秀57的相似系数达0.92，很有可能为同一个菌株;夏丰1号与夏秀888聚为一类群;中农秀珍菇和秀珍菇77聚为一类群;台秀1号单独为一类群。可见秀珍菇遗传差异较大，遗传背景丰富。

2. 2 10个秀珍菇菌株菌丝与产量情况

比较分析10个秀珍菇菌株的菌丝生长情况（表3），秀珍菇77的菌丝生长速度最快，为1.51 cm/d，显著高于其他菌株（P<0.05，下同），其次为台秀57-66和中农秀珍菇，均为1.34 cm/d，其余各菌株均比台秀57-66（对照）生长慢，秀76和秀大的菌丝生长较慢，仅1.01 cm/d。菌丝生长势方面，除台秀1号和夏秀888的菌丝生长势稍差、菌丝颜色较淡外，其余8个菌株长势均良好，菌丝洁白、浓密和整齐，各菌株间差异不明显（图3）。由表3还可知，各参试菌株在产量方面存在显著差异，中农秀珍菇的平均产量最高，达0.295 kg/袋;其次是秀珍菇12和秀珍菇777，平均产量分别为0.287和0.280 kg/袋，上述三者与台秀57-66间平均产量差异不显著（P>0.05，下同）;其余各参试菌株平均产量均显著低于台秀57-66，夏丰1号和秀大的平均产量较低，分别为0.186和0.171 kg/袋。

2. 3 10个秀珍菇菌株的商品性状

由表4可知，在10个供试菌株中，菌盖颜色有 5个为灰色、4个为浅灰色、1个为深灰色;菌盖长度为3.92～4.87 cm，宽度为4.32～5.80 cm，厚度为1.05～2.10 cm;菌柄直径为0.86～1.75 cm，菌柄长度为2.97～4.13 cm。在菌盖厚度方面，秀76和秀大的菌盖较厚（厚度>1.70 cm），夏丰1号、秀珍菇777和夏秀888菌盖较薄（厚度<1.20 cm）。在菌盖大小方面，秀大菌株菌盖较大（长×宽=4.87 cm×5.80 cm），其余各菌株菌盖大小适中。在菌柄粗细方面，菌株秀76、台秀57-66、秀57、秀珍菇12和秀大的菌柄较粗（菌柄直径>1.20 cm）;而各菌株的菌柄长度均比较适宜，均在3.00～5.00 cm范围内。从菌丝生长是否容易吐黄水来看，夏丰1号和秀大有轻微吐黄水现象。在正常出菇条件下观察10个菌株黄菇病的发生情况，秀76和秀57发病较为严重，说明其抗黄菇病能力较差，其他8个菌株发病率较低。出菇的整齐度较高的为台秀57-66、 秀珍菇12和中农秀珍菇;结合产量性状可看出，出菇整齐的菌株相對产量也较高。综合分析10个供试菌株的农艺性状可知，夏丰1号、秀珍菇777和夏秀888的菌盖偏薄，且夏丰1号和夏秀888的菌盖呈漏斗状，子实体商品性较差;秀大子实体偏大;秀76、台秀1号和秀57的产量表现较差，因此均不适宜作为推广品种使用;台秀57-66菌株作为浙江省主栽品种，其子实体大小、菌盖薄厚和菌柄大小适中，商品性状优良，深受市场欢迎，同时，秀珍菇12和中农秀珍菇与台秀57-66相比，整体差异比较小，商品性状优良、产量高，适合作为推广品种使用，台秀1号菌株虽然在产量方面表现较弱，但其在抗性和商品性方面表现较好，可作为育种材料来使用。

2. 4 秀珍菇种质资源农艺性状的遗传多样性分析

对10个秀珍菇种质资源的7个定量性状和4个定性性状进行分析，结果（表5）表明，7个定量性状的遗传多样性指数以菌盖厚度最高，为1.828，其次为产量（1.696）、菌丝生长速度（1.552）、菌柄直径（1.283）、菌盖宽度（1.198）和菌柄长度（1.058），菌盖长度的遗传多样性指数最低，为0.694。不同菌株间变异系数存在很大差异，菌柄直径的变异系数最大，为25.21%，其次为菌盖厚度，为22.13%，产量、菌丝生长速度和菌柄长度的变异系数分别为18.00%、13.82%和10.83%，菌盖宽度和菌盖长度的变异系数较小，分别为8.60%和7.76%。

由定性性状遗传多样性分析结果（表6）可知，菌盖颜色遗传多样性指数为0.943，以灰色占比例最高，为50%，其次是浅灰色，为40%，深灰色比例最低，为10%;出菇性状以无黄菇病、无吐黄水和整齐性高为主，频率分布较集中，上述3个性状的遗传多样性指数依次为0.496、0.496和0.612。

2. 5 秀珍菇菌株间农艺性状的相关分析

通过Pearson相关分析结果（表7）可知，秀珍菇产量与菌丝生长速度呈极显著正相关（P<0.01），相关系数为0.778;菌盖宽度与菌盖厚度、菌柄直径呈显著正相关，相关系数分别为0.711和0.702;菌盖厚度与菌柄直径呈极显著正相关，相关系数为0.865;其余各农艺性状之间的相关不显著。

2. 6 秀珍菇菌株间农艺性状的主成分分析

对10个秀珍菇菌株的农艺性状进行主成分分析（表8），根据特征值>1的提取方法（陈影等，2014），从中提取4个主要成分，累积贡献率达84.891%，能反映11个农艺性状的基本特征。第一主成分（F1）贡献率为34.350%，其特征向量较高的性状是菌柄直径和菌盖厚度，反映子实体的特征状况;第二主成分（F2）贡献率为23.539%，特征向量最高的性状是产量，为0.634;第三主成分（F3）贡献率为14.250%，特征向量最高的性状是菌盖颜色，为0.677;第四主成分（F4）贡献率为12.751，特征向量最高的性状是黄菇病，为0.882。上述结果说明，菌柄直径、菌盖厚度、产量、菌盖颜色和黄菇病这5个农艺性状可作为秀珍菇种质评价的指标。

3 讨论

随着分子生物学技术的快速发展，分子标记技术被广泛应用于作物群体遗传多样性研究中，而ISSR作为一种操作简单、快捷、高效的检测手段，常常用于食用菌遗传多态性分析和种内菌株亲缘关系的区分（冯伟林等，2014;江玉姬等，2015;邢志伟，2017;孙鹏，2019）。本研究利用ISSR分子标记技术能将秀珍菇菌株区分开，并将10个菌株聚为4个类群，遗传多样性丰富，具有可观的开发和利用价值，而其中秀珍菇12与秀57的遗传相似性达92%，可能存在同种异名的现象，进一步说明ISSR标记分析可揭示种源间的某些遗传差异。但并未发现子实体农艺性状、地域分布与ISS分子标记分类间的相关性，与马志刚等（2006）得出秀珍菇菌株的亲缘关系与地理位置并无相关的研究结果一致，而与冯伟林等（2014）对秀珍菇不同出菇溫型与应用ISSR分子标记分类相关性较高的研究结果不同，其中差异可能与目前我国各地频繁的相互引种有关。本研究发现，遗传系数为0.69时，菌盖厚度和菌柄直径与分子标记具有一定的相关性，但具体情况仍有待进一步研究。

种质资源是一个物种性状的基因载体，是品种选育的物质基础。而农艺性状测定则是种质资源开发利用及优质品种选育的基础工作，也是种质资源分类、鉴定和种质资源筛选的重要指标（赵梦然等，2013;陈靓，2014;葛乐，2015;崔筱等，2020）。王波等（2010）的研究结果说明运用分子标记与农艺性状结果进行综合分析，筛选确定杂交育种的亲本，是获得优良菌株的有效方法和手段;王子迎和王书通（2006）对32个香菇品种的遗传多样性分析表明，选择遗传距离较大的亲本组合，其杂种优势也会越强。本研究的农艺性状结果表明，不同子实体间性状差异较大，其中，秀珍菇12和中农秀珍菇的子实体商品性佳，产量高，可作为推广品种使用，而台秀1号抗性较强，产量相对较低。依据分子标记结果，3个菌株的亲缘关系较远，均也可作为杂交育种材料来使用。同时对10个秀珍菇菌株的菌丝生长、子实体农艺性状和产量等农艺性状进行综合评价分析，发现秀珍菇种质资源存在丰富的遗传多样性，不同性状的多样性指数在0.496～1.828，遗传多样性指数越高，其性状遗传多样性越丰富，丰富的多样性为育种和遗传改良奠定良好的基础。主成分分析也进一步揭示变量间的相关性，确定菌柄直径、菌盖厚度、产量、菌盖颜色和黄菇病等5个性状可作为主要评价指标，为秀珍菇优质种源的筛选与选育提供依据。

4 结论

通过秀珍菇农艺性状和遗传多样性分析，综合菌丝生长情况、出菇整齐度、吐黄水情况和抗黄菇病等方面，筛选出各栽培性状表现较好的秀珍菇12和中农秀珍菇，其可作为栽培推广菌株和品种选育的亲本使用;抗性较好的台秀1号菌株可作为品种选育的亲本菌株使用。3个菌株均具有较好的应用潜力，为秀珍菇的品种选育及栽培提供优质种源。

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（责任编辑 邓慧灵）