沙棘种子内生细菌对几种植物种子萌发的影响

陈 鑫，李曦冉，杨姣姣

（西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州 730070）

植物内生菌是在植物生活史的部分及全部阶段，存在于植物不同组织中并和宿主植物建立互惠共生的一类微生物［1］。研究发现，植物内生菌能产生吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA），在植物生长发育中直接促进植物的生长［2］。近年来，不同植物内生菌逐渐成为农业等领域的研究热点［3］。傅本重等［4］发现核桃内生细菌可以抑制病原真菌，促进种子的萌发。陈世萍等［5］发现室温水分胁迫下内生真菌感染可以提高黑麦草超氧化物歧化酶和过氧化物酶的活性。沙棘（H.rhamnoides）广泛分布于我国干旱与半干旱地区，其根系发达，能够生长在环境严酷、不同海拔的干燥寒冷的贫瘠地区［6］，可作为水土流失严重、干旱贫瘠地区的先锋树种，改善土壤环境［7］。目前国内对于沙棘内生菌的研究较少，本课题组发现［8］沙棘除了在根瘤中存在内生细菌，沙棘种子中也含有丰富的内生菌资源。

兰州地处甘肃省中部，由于受到西北独特气候环境等影响，兰州北山植被覆盖率较低。兰州北山植物绿化主要靠人工栽植［9］，植物种子繁殖因受到土壤等环境的限制，萌发率较低，植株幼苗的生长繁殖也受到一定限制。本实验选取北山具有绿化价值的乔木、阔叶类灌木和藤本、草本四类植物种子［10］，共13 种作为实验材料，通过沙棘种子中筛选出产IAA 能力强的内生菌，深入研究沙棘种子内生菌的促生能力，探究其对甘肃兰州北山常见的植物种子萌发的影响，促进其种子繁殖，以期为兰州北山绿化提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

供试的17 株沙棘种子内生细菌由张爱梅等采用纯培养法分离自甘肃省榆中县马衔山的野生中国沙棘种子样品中，于4℃甘油管中保存。纯化后菌株编号分别为H1B01、F2B04、G2B03、D2B03、J2B04、G2B05、D2B12、D1B01、F3B01、J3B02、F2B01、A1B08、H3B05、H2B03、G3B06、J2B05、J3B10。

1.1.2 供试种子

供试植物种子共13 种，分别是角茴香（H.erectum）、细叶韭（A.tenuissimum）、宁夏枸杞（L.barbarum）、鹅绒藤（C.chinenese）、曼陀罗（D.stramonium）、灌木铁线莲（C.fruticosa）、波斯菊（C. bipinnata）、五叶地锦（P.quinquefolia）、牵牛花（P.nil）、臭椿（A. altissima）、刺槐（R.pseudoacacia）、侧柏（P.orientalis）、沙枣（E.angustifolia），以上材料均以五点取样法采样于兰州北山西北师范大学新校区北山段。试验前将各植物种子置于室温通风保存备用。

1.1.3 培养基

1.2 试验方法

1.2.1 沙棘种子内生细菌产IAA菌株的筛选

采用Salkowski 比色法［11］测定沙棘种子内生细菌IAA的产量。

（1）定性测定：将沙棘种子内生细菌接种到150 mL的三角瓶中。在37℃200 r·min-1的条件下，恒温震荡培养1 d 之后以1%接种量接种到含有500 mg·L-1色氨酸的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，以无菌水为对照组，37℃180 r·min-1恒温震荡培养3 d。最后，将发酵液7000 r·min-1离心5 min，取50uL 上清液于白瓷板中，向其加入100uL 的IAA 显色剂，两者充分混合，置于黑暗条件下避光反应30 min，观察其颜色变化。如出现粉红色，则说明菌株呈阳性，有IAA产生。

（2）定量测定：取2 mL 阳性菌株上清液于试管中，向其加入4 mL 的IAA 显色剂，每组3 个重复，黑暗条件下避光反应30 min，测定其在530nm 的吸光值，以无菌水为对照组。以纯IAA 绘制标准曲线测定各菌株IAA的产量［12］。

（3）IAA 标准曲线的绘制［11］：以纯吲哚乙酸，分别配置0.5 、1.0 、1.5 、2.0、2.5 mg·L-1的吲哚乙酸溶液，在530 nm 处分别测定其吸光值。以IAA 标准溶液质量浓度（x）为横坐标，530nm 吸光值（y）为纵坐标绘制标准曲线，得到IAA 标准曲线回归方程为y=0.036 4x+0.040 1，相关系数为R2=0.999 0。

1.2.2 内生细菌发酵液的制备

将菌株接种到三角瓶中，37℃200 r·min-1恒温震荡培养24 h 之后以1%接种量接种到含有色氨酸的牛肉膏蛋白液体培养基中，使色氨酸的浓度为500 mg·L-1，37℃180 r·min-1恒 温 震 荡 培 养36 h备用。

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1.2.3 种子预处理

将曼陀罗、刺槐、沙枣、角茴香、细叶韭、五叶地锦和臭椿［13］七种种皮较厚的种子用50℃的温水浸泡24 h，然后用自来水将13 种种子冲洗干净备用。加入75%的乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗3～4 次，再加入1%NaClO 浸泡5 min，无菌水冲洗3～4次，对各植物种子进行表面消毒。最后从每类植物中分别选取大小均一、饱满的种子，置于无菌水中浸种24 h。

1.2.4 内生细菌对植物种子萌发的影响

所有种子于超净台上进行种皮表面自然风干后，置于垫有双层湿润滤纸的无菌培养皿中。每皿10 粒，每个处理做三次重复。该试验分为两个实验组和一个对照组，即①无菌对照组，②含菌发酵液处理组，③发酵液的上清液处理组。①②③组均用无菌水浸种24 h，萌发过程中，对照组①补充无菌水，试验组②补充含菌的发酵液，实验组③补充发酵液上清液。除曼陀罗种子进行全黑暗条件处理［14］外，其他12 种植物种子每天光照12 h。臭椿、灌木铁线莲、沙枣种子于15℃恒温培养15 d［15］，其余10 种种子25℃下恒温培养15 d，每天定时记录各组试验的发芽情况。萌发指标以种子吐白为准，测定其发芽率、发芽势［16］，计算公式如下：

发芽率（%）=第15 天发芽种子数/供试种子总数×100%

发芽势（%）=第4 天种子的发芽率/供试种子总数×100%

1.2.5 数据处理

运用SPSS21.0 对试验数据进行统计分析，Origin7.5进行制图。

2 结果与分析

2.1 沙棘种子内生细菌产IAA内生菌的筛选

通过Salkowski 比色法对分泌IAA 的沙棘种子内生细菌进行筛选。在定性测定中，17 株内生细菌产IAA 的显色反应如图1 所示，其中6 株菌呈阳性，分别是菌株H2B03、A1B08、H3B05、F2B01、F3B01、D2B12，菌株H2B03显色反应最为明显。

图1 17株供试菌的显色反应Fig.1 Chromogenic reaction of 17 tested strains

通过定性测定筛选出6 株阳性菌，对其进行产IAA 的定量测定。结果显示，显色反应最为明显的菌株H2B03，其IAA 产量最高，为22.15 μg·mL-1（表1），此时的菌液浓度为1.56×109CFU·mL-1。菌株H3B05 的IAA 产量最低，为1.52 μg·mL-1，其余4 株菌IAA产量均低于4.00 μg·mL-1。因此，在后续的试验中，选取菌株H2B03进行种子萌发试验。

表1 6株供试菌产IAA量Table 1 IAA yield of 6 tested strains

2.2 种子萌发试验

2.2.1 两种处理下不同植物种子的萌发状况

采用IAA 产量最高的菌株H2B03 分别对13 种植物种子进行萌发试验，通过H2B03 上清液处理和发酵液处理，试验结果如图2 所示。13 种植物种子具有普遍发芽率较低的情况，其中臭椿、灌木铁线莲、角茴香、沙枣和曼陀罗5种植物种子在萌发试验中不发芽；除细叶韭、五叶地锦种子外，宁夏枸杞、侧柏、鹅绒藤、波斯菊、刺槐和牵牛花6 种种子的萌发指标在两种处理下相对于无菌对照组均有降低的趋势。可见，菌株H2B03 对宁夏枸杞、鹅绒藤、波斯菊、刺槐、牵牛花6 种种子的萌发具有抑制作用，但对细叶韭、五叶地锦有一定的促进作用。

2.2.2 两种处理对同一种植物种子萌发的影响

用菌株H2B03 分别对13 种植物种子进行上清液处理和发酵液处理，测定H2B03 的两种处理对同一种子萌发的影响（表2）。不同植物种子的萌发因对不同的处理敏感性不同。臭椿、灌木铁线莲、角茴香、沙枣和曼陀罗在各处理下均不发芽；上清液处理中：侧柏的发芽率（20.5%）、发芽势（19.6%）明显低于对照组的发芽率（72.1%）、发芽势（41.6%）P＜0.05，细叶韭发芽率相比于对照组提高了31.3%，五叶地锦的发芽率相比于对照组提高了9.5%；发酵液处理中：只有细叶韭种子萌发，其发芽率、发芽势分别为21.2%、20.0%，均低于上清液处理的发芽率（31.3%）、发芽势（30.1%）。

2.2.3 同一处理对不同植物种子萌发的影响

从表2 可以看出，通过菌株H2B03 对13 种植物种子分别进行上清液处理和发酵液处理，同一种处理下不同种子间的萌发状况有很大的差异（P＜0.05）。在上清液处理下，只有细叶韭、侧柏、五叶地锦种子有发芽的趋势，发芽率分别为31.3%、20.5%、9.5%；在发酵液处理下，除细叶韭外，宁夏枸杞、侧柏、鹅绒藤、波斯菊、刺槐、牵牛花和五叶地锦种子无萌发的迹象。其中细叶韭种子的发芽率、发芽势分别为21.2%、20.0%。

3 讨论

本试验从17 株沙棘种子内生细菌中筛选到6株产IAA 的菌株，各菌株IAA 的分泌量为1.52～22.15 μg·mL-1，其分泌量最高的菌株是H2B03。不同植物的内生细菌分泌IAA 的量有一定的差异，丁森等［17］从樱花体内分离到一株瓦雷兹芽孢杆菌，其在第七天IAA 的生成量为9.174 μg·mL-1；而刘琳等［18］从春兰根组织中获得57 株分泌IAA 内生细菌，其IAA 分泌量为0.50～129.68 μg·mL-1。采用菌株H2B03的发酵上清液处理和含菌发酵液对采摘于兰州北山的种子进行萌发试验。结果表明，臭椿、灌木铁线莲、角茴香、沙枣和曼陀罗种子在两种处理下均不发芽。原因可能与四方面因素有关，第一，这几种植物种皮较厚，透水透气性低，且角茴香、曼陀罗种子表面存在蜡状胶质，不利于种子吸收水分［19］；第二，也可能是因为这几种植物种子萌发周期较长，需适当延长其萌发时间；第三，这几种植物种子没有经过自然界冬季的低温处理，其发芽率降低。研究发现，冬季过低的气温以及较大的温度变幅（-26℃～10℃）可以使部分种子萌发率升高［20］；第四，种子休眠未被打破。Baskin 将种子休眠分为生理休眠等5种类型，针对不同类型的休眠，其打破休眠的方式各有不同［21］。本试验为了控制变量，针对种皮较厚的种子统一使用了物理方式（50℃温水浸泡24 h）处理，这可能也是种子不萌发的原因之一。

IAA 作为一种植物生长激素，对不同植物种子的萌发及生长均有最适处理范围，浓度过低促进作用不明显，浓度过高则表现为抑制生长［22］。本文中分离自沙棘种子的内生菌产生的IAA的浓度不利于宁夏枸杞等6 种植物种子的萌发，且菌株H2B03 发酵液中，可能含有的代谢产物也会抑制种子的萌发。有研究发现，木麻黄林地特有细菌代谢产物对青皮、红厚壳和杨叶肖槿种子萌发均有抑制作用［23］。此外代谢产物的浓度也可能是抑制种子萌发的原因之一，蒋先军等［24］研究表明，细菌代谢产物对植物生长的刺激作用与浓度有关，如高浓度的硅酸盐细菌代谢产物对植物生长有一定的抑制作用，且对根系生长的影响尤为明显。

本试验中，H2B03 上清液处理对细叶韭和五叶地锦种子的萌发有一定的促进作用。其中细叶韭种子的萌发率（31.3%）显著高于对照组（P＜0.05），五叶地锦相比于对照组发芽率提高到了9.5%。有研究发现，刚采收的内蒙古地区野生细叶韭植物种子的萌发率极低，存在自然休眠期，最高萌发率只有25.5%，贮藏7 个月后在适合的萌发条件下，其萌发率能达到98.0%［25］。本试验采集的细叶韭在室温下只储存了2个月，萌发率达到31.3%，可见，H2B03发酵液的上清液处理有利于打破细叶韭种子休眠。本试验研究结果表明，如采用菌液H2B03 对细叶韭和五叶地锦种子进行处理，将会促进细叶韭和五叶地锦两种植物种子的萌发，促进种子繁殖，有利于兰州城市绿化。