光敏水凝胶免疫识别严重急性呼吸综合征冠状病毒2 Spike蛋白的快速纳米检测方法*

段醒妹 ，陈小华 ，帅 明

（1. 电子科技大学医学院，四川 成都 610054；2. 四川省医学科学院·四川省人民医院，四川 成都 610072；3. 个体化药物治疗四川省重点实验室，四川 成都 610072）

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）可导致病毒性肺炎或肺部感染，传染性高，具有广泛的组织嗜性［1］。自2019 年新型冠状病毒肺炎疫情暴发以来，基于聚合酶链式反应（PCR）技术的核酸检测试剂盒发挥了重要作用，但存在以下问题。1）SARS - CoV - 2为RNA 病毒，需依次完成样本处理、集中送检，流程复杂，无法满足快速、高通量的检测需求，若仅采用核酸检测，易造成医疗拥挤，且部分患者无法及时确诊，导致治疗延误或疫情扩散；2）核酸检测条件要求较高，需专业人员和较严格的实验室条件；3）部分无症状感染者携带病毒量较低，采集的样本中SARS-CoV-2核酸含量较低、PCR 实验操作失误或样本发生污染等均会产生假阴性结果［2-4］。本研究中基于抗原-抗体免疫识别反应、纳米技术与光敏水凝胶技术，建立了快速检测SARS-CoV-2 Spike（S）蛋白的方法。现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

N-1300D-W 型旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；透析袋（北京索莱宝科技有限公司，批号为807D022）；WF - 501B 型蓝光手电筒（美国 UltraFire 神火公司）；GR110DP 型高压灭菌器（美国致微仪器公司）。

1.2 试剂

马来酰亚胺- 聚乙二醇- 聚己内酯（Mal- PEG -PCL）聚合物（批号为RP01631084），甲氧基聚乙二醇-聚己内酯（mPEG-PCL）聚合物（批号为RM019155），均购自西安瑞禧生物科技有限公司；S 蛋白抗体［Human anti - SARS - CoV - 2 Spike RBD antibody（hFC），成都正能生物技术有限责任公司，批号为S209906］；S 蛋白（美国OriGene公司，批号为TP701142）；光引发剂Irgacure 2959（Merck & Co.，Inc.，批号为410896）；甲基丙烯酸酐（MA，批号为EFL - GM - 30），明胶（批号为EFL -GEL - 001），均购自苏州永沁泉智能设备有限公司；Hepes 缓冲液（广州赛国生物科技有限公司，批号为EZ2811C237）；其余试剂均为分析纯，购自美国Sigma-Aldrich公司。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

溶液A：分别取mPEG-PCL聚合物［相对分子质量（Mr）为4 000，PEG 和PCL 的Mr均为2 000，化学结构式见图 1 A］10 mg 和 Mal - PEG - PCL 聚合物（Mr为4 000，PEG和PCL的Mr均为2 000，化学结构式见图1 B）90 mg，混匀，用二氯甲烷［5-6］溶解，置温度为60 ℃的旋转蒸发仪中45 min，成膜。将膜取出，溶解于去离子水（或双蒸水、纯化水、生理盐水）中。在60 ℃水浴条件下振荡5 min，得质量浓度为10 mg/ mL 的聚乙二醇- 聚己内酯-马来酰亚胺（MP-Mal）纳米粒溶液，置4 ℃条件下保存，备用。分别取MP-Mal纳米粒溶液100 mL和SARS - CoV - 2 S 蛋白抗体 100 mg，溶于 Hepes 缓冲液中，混匀，置4 ℃条件下过夜，即得质量浓度为10 mg/mL的S 蛋白抗体-MP-Mal 纳米粒溶液，置4 ℃条件下保存，备用。取Irgacure 2959（化学结构式见图1 C）1.12 g（5 mmoL）、巯基乙酸0.24 mL（3.4 mmoL）、对甲苯磺酸0.16 g（0.83 mmoL），溶于50 mL 二氯甲烷中，在氮气保护下，于冷凝管中加热回流5 h，用旋转蒸发仪蒸干溶剂，最后用柱层析分离，即得目标修饰产物2- 巯基乙酸-2-［4-（2-羟基-2-甲基丙酰基）苯氧基］乙酯和疏基 - Irgacure 2959。取S 蛋白抗体 - MP - Mal 纳米粒溶液 10 mL、疏基 -Irgacure 2959 6 mg，溶于Hepes 缓冲液，混匀，置4 ℃条件下过夜。将混合溶液置透析袋（Mr为2 000）中，透析液为蒸馏水，置4 ℃条件下过夜，即得S蛋白抗体-MP-Irgacure 2959纳米粒溶液（溶液A），置4 ℃条件下保存，备用。

图1 化学结构式A.mPEG-PCL polymer B.Mal-PEG-PCL polymer C.Irgacure 2959Fig.1 Chemical structures

溶液B：取纯化水，置500 mL锥形瓶中，于121 ℃高压灭菌器内灭菌40 min；将灭菌后的纯化水（溶液B）分装于安瓿瓶中，每瓶2 mL，密封，保存。

溶液C：取明胶10 g，精密称定，置100 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，60 ℃条件下搅拌至溶解，用滴液漏斗将8 mL MA缓慢滴入明胶溶液中，50 ℃条件下反应3 h。加入40 ℃预热的PBS 400 mL，将明胶溶液稀释5 倍，用透析袋（Mr为12 000～14 000）在温度为40 ℃、转速为300 r/min 条件下透析7 d，再冻干7 d，使之呈白色泡沫状，即得甲基丙烯酰化明胶（GelMA），于4 ℃条件下保存。将 GelMA 用 PBS 溶解至浓度为 25%（m/V）的GelMA 水凝胶溶液（溶液C），以每瓶1 mL 的量分装，于4 ℃条件下密封、避光，保存。

2.2 检测方法

1）取出咽拭子，去包装，将其浸入SARS - CoV - 2 S 蛋白溶液1 cm，充分沾染S 蛋白。2）取出咽拭子，插入溶液A 中，使拭子头完全浸没于溶液，搅拌3～5 s，使咽拭子上的SARS - CoV - 2 S 蛋白与溶液中纳米粒子上偶联的抗体形成较紧密的非共价结合。3）从溶液A中取出咽拭子，插入溶液B中，使拭子头完全浸没于溶液，搅拌3～5 s，充分洗涤。4）从溶液B 中取出咽拭子，插入溶液C 中，使拭子头完全浸没于溶液，搅拌3～5 s，取出。5）用蓝光手电筒（照射波长为405 nm）持续照射5～20 s，装载溶液C 的试剂瓶与水平面保持垂直，光源入射角度需保证试剂瓶内溶液充分接受照射，倒置试剂瓶，使瓶身与水平面夹角为45°，观察瓶内溶液是否凝固，若瓶内溶液由液态转变为固态，溶液不沿瓶壁向下流动，为阳性，即含SARS-CoV- 2 S 蛋白；反之则为阴性，即不含SARS-CoV-2 S蛋白。

2.3 检测溶液制备原料比例的确定

通过前期筛选试验确定MP - Mal 纳米粒中Mal -PEG - PCL 聚合物与mPEG - PCL 聚合物的质量比为0.2～9.0。其中，Mal - PEG - PCL 聚合物的质量为90 mg，mPEG - PCL 聚合物的质量为 10～450 mg。优选Mal-PEG-PCL 聚合物9份（每份10 mg），mPEG-PCL聚合物 1 份（10 mg），mPEG - PCL 聚合物的Mr为4 000～8 000，mPEG-PCL（1∶1，Mr/Mr）；Mal-PEG-PCL聚合物的Mr为4 000～8 000，PEG-PCL（1∶1，Mr/Mr）。

前期制备溶液A 时，疏基-Irgacure 2959 的质量为5～10 mg，在此范围内，S 蛋白抗体 - MP - Irgacure 2959 纳米粒可有效结合光敏水凝胶；同时，每次反应S 蛋白抗体- MP - Mal 纳米粒中S 蛋白抗体的质量为50～100 mg，在此范围内，S 蛋白抗体 - MP - Mal 纳米粒可有效结合SARS-CoV-2 S 蛋白，并使溶液C 中的光敏水凝胶固化。

Irgacure 2959 为一种蓝光引发剂，在波长为405 nm的蓝光作用下可迅速吸收能量，产生自由基、阳离子等，从而引发光敏水凝胶固化反应。本研究中，疏基-Irgacure 2959 的质量为 5～10 mg，且溶液 C 中 GelMA 水凝胶溶液的浓度为5%～30%（m/V）时，经405 nm 波长的蓝光照射，能在光催化剂的作用下固化。

3 讨论

SARS - CoV - 2 的感染过程是由其表面的S 蛋白与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2 相互识别开启的［7-8］，S 蛋白是一类三聚体跨膜糖蛋白，在病毒表面形成特殊的花冠结构。SARS-CoV - 2 进入易感细胞，需与S蛋白的受体结合和蛋白水解的协同作用，促进病毒与细胞融合。由于S 蛋白暴露于病毒表面，并介导病毒进入宿主细胞，故可作为SARS-CoV-2 的抗原，是抗病毒药物、治疗性抗体、诊断方法等开发的关键靶标［9-10］。

纳米技术是研究结构尺寸为1～100 nm 范围内材料的性质和应用的一种技术，最终目标是直接以原子或分子形式构造具有特定功能的产品［11-12］。纳米颗粒表面可提供偶联位点，将能特异性识别S蛋白的抗体和光引发剂共同偶联于纳米颗粒，以纳米颗粒为介质，可将光敏水凝胶技术与免疫识别技术相结合。

mPEG-PCL 是一种两嵌段聚合物，一端为亲水链段甲氧基聚乙二醇，另一端为亲油链段聚ε- 己内酯，生物相容性和安全性均良好［13］。Mal-PEG-PCL 不仅具有生物可降解性、生物相容性、两亲性，且能在水溶液中自动组装为纳米颗粒，还能通过马来酰亚胺基团与抗体进行共价偶联，是理想的纳米药物功能化载体骨架材料。

S 蛋白抗体可与SARS - CoV - 2 S 蛋白的抗原结合，从而发生免疫反应［14-15］，使SARS-CoV-2 与S 蛋白抗体- MP - Irgacure 2959 纳米粒相连。本研究中制得的S 蛋白抗体 - MP - Irgacure 2959 纳米粒能与SARS-CoV-2 S 蛋白有效结合，使 SARS-CoV-2 牢固连接在纳米粒上，且能使光敏水凝胶在接触带有SARS-CoV-2的纳米粒溶液时迅速固化。

GelMA 为双键改性明胶，在光引发剂的作用下，可通过紫外光及可见光交联固化成胶。GelMA 光敏水凝胶具有天然和合成生物材料的特征，其三维结构适于细胞生长和分化，生物相容性和细胞反应特性良好［16-17］。在405 nm波长的蓝光作用下，Irgacure 2959可使GelMA光敏水凝胶实现液态-固态的相互转变。

综上所述，本研究中建立的方法生产成本低，检测效率高，易于贮存和运输，对设备和操作人员的依赖性低，可用于快速检测SARS-CoV-2表面的S蛋白。