新疆紫草的红外指纹图谱及高效薄层色谱研究*

闫晓彩，丁文欢，敬晓莉，徐海燕

（新疆医科大学 中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011）

紫草作为一种传统中药，在国内外均有研究。在国内，新疆紫草主要分布于天山南北坡和西藏的西部，国外如尼泊尔、巴基斯坦、阿富汗等地也有分布。其主要生长于高海拔地区的山地、草地及草甸等处。紫草含有醌类、酯类、酚酸类、脂肪族及黄酮、多糖[1-6]等成分，其中国内外对其醌类成分研究较多。发现紫草的醌类成分具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤以及促进伤口愈合[7]等作用。

本研究采用红外光谱法及HPTLC 法，简单、快速的建立紫草的红外图谱及薄层色谱，为不同产地新疆紫草的快速鉴别提供了帮助，也为后续研究提供了一种高效、快速的方法。

1 实验部分

1.1 仪器及材料

SpectrumⅡ型傅里叶变换红外光谱仪（美国Perkin Elmer 公司）；YP-2 型压片机（上海山岳科学仪器有限公司）；AB265-S（1/10 万）型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；多功能粉碎机（上海缘沃工贸有限公司）；KQ5200DE 型超声波清洗器(昆山市超声仪仪器有限公司）；HH-S4 型数显恒温水浴（金坛市医疗仪器厂）；薄层色谱展开缸（100mm×200mm；中国上海）；移液管；100μL 微量进样器（中国上海安亭微量进样器厂）；CAMAG 扫描仪、CAMAG 数字成像系统、CAMAG 半自动定位仪器，均来自瑞士CAMAG。

KBr（光谱纯 经过研磨后烘干并密封备用）；HPTLC 硅胶G 板（20210319 安徽良辰硅源材料有限公司）；净化水（新疆医科大学中心实验室自制）；石油醚、甲醇、乙酸乙酯、二甲苯、甲酸，纯度大于99%，天津市北联精细化学品开发有限公司；左旋紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素，均为10mg，纯度＞98%，Tauto Biotech。

表1 新疆紫草编号及来源Tab.1 Numbers and sources of Arnebia euchroma

1.2 样品处理

1.2.1 红外光谱样品制备 将新疆紫草粉碎后过200 目筛，取1g 置于EP 管中，密封保存。为减少H2O的影响，实验前将药材置于60℃烘箱进行干燥4h，KBr 置于120℃烘箱干燥5~6h（KBr 应少量多次进行干燥）。

1.2.2 薄层色谱样品制备 称取样品各1g，加入40mL 石油醚，100Hz 超声40min，过滤后将滤液置于蒸发皿中水浴蒸干，用甲醇将其溶解并定容至1mL，浓度为1g·mL-1。

1.2.3 标准品制备 分别称取5.00mg 左旋紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、乙酰紫草素及β,β-二甲基丙烯酰紫草素4 种化学成分，用甲醇将之溶解，定容至5mL。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱采集

先将光谱仪预热1h。以空白KBr 为背景，将片制成厚度约为1mm 透明薄片，20s 后取出。将完好压片放入红外光谱分析仪中扫描，扫描条件：以400~4000cm-1作为扫描范围，扫描次数为16 次，分辨率为4cm-1。新疆紫草以每份2.0mg 与KBr 按1∶80比例混合，研磨均匀后进行压片、扫描，得光谱图并导出数据。

2.1.1 各紫草的红外光谱及特征 将峰值及编号输入OriginPro 8.5.1 软件，以波长为横坐标，透射率为纵坐标，设置各样本间距为0.15，制作不同产地新疆紫草的红外光谱，见图1。

图1 新疆紫草红外光谱图Fig.1 Infrared spectra of Arnebia euchroma

由图1 可见，除个别新疆紫草外，所有紫草均在3400、2920、1735、1615、1513、1425、1376、1260、1053、600、535cm-1附近有吸收。其中，超3/4 的新疆紫草在2852、465cm-1附近有吸收；超1/2 的新疆紫草770、672cm-1附近有吸收；X-6、X-7、X-9、X-10、X-15、X-16 在810-831cm-1之间有吸收；X-5、X-7、X-16 在1335cm-1附近有吸收；X-3、X-5、X-8 在1155 cm-1附近有吸收；只有X-6 在1105cm-1附近有吸收；部分新疆紫草在1033cm-1附近有吸收。

2.1.2 各紫草的相似度分析 利用SPSS 统计软件，均以1 号产地紫草为对照，进行相似度分析，结果见表2。

表2 新疆紫草的相似度分析Tab.2 Similarity analysis of Arnebia euchroma

由表2 可得，各紫草的相似度均大于0.97，即药材的质量存在较小的差异。

2.1.3 各紫草的聚类分析 利用SPSS 21.0 软件将新疆紫草进行聚类分析。用平均连接法树状图，以欧式距离平方为基准进行分析，结果见图2。

图2 新疆紫草聚类分析图Fig.2 Analysis of Arnebia euchroma cluster analysis

由图2 可知，当欧式距离为15 时，新疆紫草可以分为3 类；当欧式距离为20 时，新疆紫草可以分为两类；当欧式距离大于25 时，新疆紫草才可以归为1 类。

2.2 高效薄层色谱法的检测结果

样品需经过滤膜（0.22μm）过滤。经过多次调整，最终确定了展开条件以石油醚∶二甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸为6∶4∶0.5∶0.5 最佳。各样品设置点样量为2μL,白光照射，获得其日光图，见图3。

图3 标准品及样品日光图Fig.3 Chromatograms of the standardsand samples taken under white light

将4 种化学成分的标准品与样品在400~700nm处用TLC 扫描仪扫描，测定最大吸收波长为522nm。

2.2.1 方法学考察

（1）线性 分别精确吸取左旋紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁及乙酰紫草素标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μL；β,β-二甲基丙烯酰紫草素0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μL。以标准品的质量作为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线。4 种成分的回归方程分别为y=5313x+6307.4，R2=0.9912；y=4851.4x+3953.8,R2=0.9947；y=4431x+5690.9,R2=0.9902 和y=5081.1x+1178.2，R2=0.9987。

（2）精密度 精确吸收各标准品溶液2.0μL 进样6 次后，检测其峰面积，发现4 种化学成分的RSD分别为2.57%、2.37%、2.67%及2.71%，均小于5%。

（3）稳定性 精确吸收同一批样品（X-7），检测在0、6、12h 时的峰面积，结果发现，X-7 中4 种化学成分的RSD 分别为0.07%、2.85%、2.02%、0.86%。

（4）重复性 根据供试品制备方法提取6 份同一样品（X-7），进样6 次后，检测其峰面积，发现4种化学成分的RSD 分别为2.75%、2.85%、1.16%及1.79%。

（5）加标回收率 通过线性已知各样品含量，称量约为1g 的X-4 粉末，分别加入约为样品含量的80%、100%和120%的4 种化学成分标准溶液。各平行制备3 个样品，通过峰面积计算回收率，结果见表3。

表3 加标回收率结果Tab.3 Results of the recovery test

由表3 可知，左旋紫草素的回收率在98.00%~102.06%之间，平均回收率为99.68%；β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁的回收率在98.16%~101.65%之间，平均回收率为100.21%；乙酰紫草素的回收率在96.32%~102.92%之间，平均回收率为100.20%；β,β-二甲基丙烯酰紫草素的回收率在96.04%~100.94%之间，平均回收率为98.10%。说明该方法对4 种化学成分的测定准确可靠。

（6）含量测定 在522 nm 处扫描测定18 批新疆紫草中4 种化学成分的峰面积，并将其带入对应的线性方程，计算其含量，结果见表4。

表4 各样品中4 种成分含量测定结果（mg·g-1）Tab.4 Results of the content of the four components ineach sample（mg·g-1）

2.3 讨论

经研究报道，左旋紫草素具有抗宫颈癌及抑制破骨细胞分化的作用[8,9]。β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁具有抗食管癌的作用[10]，乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素均具有抗结肠癌的作用[11]。其中乙酰紫草素还具有抑制乳腺癌的发生、改善肺炎、抗黑色素瘤等多种抗癌作用。

与《中国药典》相比，展开剂石油醚∶二甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸为6∶4∶0.5∶0.5 的条件下，分离度更好且二甲苯比苯的毒性更低，更有益于人体健康与绿色环境。

3 结论

（1）本研究采用红外光谱，将光谱图进行13 点平滑，基线校正后，对18 批新疆紫草进行对比分析，发现各紫草间的相似度较高。故红外光谱无法更好的区分各紫草，其只能证明各紫草中所含官能团差异较小。

（2）高效薄层色谱研究发现，18 批新疆紫草中左旋紫草素的含量在0.05~1.47mg·g-1之间；β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁的含量在0.36~2.53mg·g-1之间；乙酰紫草素的含量在0.14~6.32mg·g-1之间；β,β-二甲基丙烯酰紫草素的含量在0.49~13.89mg·g-1之间。由此可见，不同产地的新疆紫草间4 种化学成分的含量差异较大。