左归丸治疗骨质疏松的网络药理学分析❋

黄胜男， 张 颖， 王如然， 冯艳华， 黄浩然， 陈 君

(中国中医科学院广安门医院南区， 北京 102618)

骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种常见的骨骼疾病，多见于绝经后妇女和老年男性。该病以骨量减少、骨微观结构退化为病理特征，易导致脆性骨折的严重后果[1]。当前针对骨质疏松症的治疗药物主要基于钙制剂、维生素D以及双磷酸盐类药物[2]。中医认为，骨质疏松属于中医学“骨痿”“骨枯”“骨空”等范畴。《景岳全书》左归丸是经典的补肾壮骨名方，由熟地黄、山药、枸杞、山茱萸、鹿角胶、龟板胶、菟丝子、川牛膝组成，具有滋阴补肾、填精益髓之效，临床用药历史悠久，如采用经方左归丸治疗绝经后骨质疏松[3]、肝肾不足证骨质疏松[4]等。课题组前期在临床与实验研究中，应用左归丸治疗肾虚型骨质疏松疗效确切[5，6]。当前针对左归丸的作用机制研究取得了一定的进展。有报道显示，其可通过调控AMPK/mTOR信号通路促进绝经后骨质疏松症大鼠骨形成[7]。另有研究显示，左归丸对于去势骨质疏松模型大鼠的Wnt/β-catenin通路具有一定的调控作用[8]。此外，OPG/RANKL信号通路[9]以及钙转运相关通路[10]也被证明是左归丸的潜在作用机制，但其药效物质基础与作用机制的相关性还有待进一步阐明。

网络药理学是基于药物分子、作用靶点、疾病三者的生物网络构建，预测药物对疾病作用机制的新兴学科[11]，并以其具有的整体性、系统性的学科特点，与传统中医整体观、辨证论治的个性化治疗高度契合，因此被广泛用于中药及其复方药效成分与作用机制相关性的预测。本研究将运用网络药理学方法，探讨左归丸多靶点、多途径治疗骨质疏松的作用机制，以阐释其“补肾壮骨”治法的生物学基础。

1 方法

1.1 左归丸中药信息收集及靶标数据库构建

从《中华人民共和国药典》一部(2020年版)(简称《药典》)查找左归丸所含8味中药(熟地黄、山药、枸杞子、鹿角胶、龟甲胶、川牛膝、菟丝子)的归经信息；以中药的拼音名为检索词，从TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和/或BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)检索该中药化学成分及对应靶标。TCMSP的筛选标准为口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、类药性(drug-likeness, DL)≥0.18[12]，剔除没有靶标信息的化学成分，从 Uniprot(http://www.uniprot.org/)将相应靶标蛋白名转换为基因名；BATMAN-TCM数据库筛选标准为Score cutoff ≥20、P值≤0.05，收集化学成分和靶标[13]。

1.2 骨质疏松相关基因数据库的构建

以“osteoporosis”为检索词，搜集DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/)[14]和Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca/)[15]中治疗骨质疏松的潜在靶点，DisGeNET数据库中筛选标准为Score_gda≥0.4；Drugbank数据库中“targets”名称通过 Uniprot转换为基因名。

1.3 网络构建与分析

利用Cytoscape3.7.1软件构建和分析左归丸治疗骨质疏松的中药-归经网络、靶标-疾病网络。中药-归经网络是将中药拼音名和相应归经分别导入Cytoscape3.7.1软件，分析网络参数(连接度)；靶标-疾病网络是导入高质量蛋白组学数据库HINT(High-quality INTeractomes)中物种为人的高质量二元蛋白-蛋白相互作用网络作为背景网络[16]，把骨质疏松疾病基因映射到HINT网络，提取疾病基因网络，再将左归丸靶标基因与疾病基因取交集后，映射到疾病基因网络，提取网络节点和边，保留最大连通片，再进行Community cluster(Glay)分析并分解成网络子模块。

1.4 重要靶标功能富集分析

采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)平台分别对左归丸靶标分布较多的网络子模块中节点基因进行功能富集分析[17]。选择蛋白相互作用(Protein Interactions)功能聚集分析(Functional Annotatin Clustering)，分析网络子模块蛋白功能；通过京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路分析，获得左归丸治疗骨质疏松的重要信号通路。

2 结果

2.1 中药-归经网络分析

左归丸所含的8味中药归肝(Liver)、肾(Kidney)、脾(Spleen)、心(Heart)、肺(Lung)经(见图1)，网络连接度排名前2位的是肾经、肝经，分别为8、7，即左归丸所含的8味中药全部都归肾经，7味归肝经，2味归脾经，各有1味中药归肺经和心经。

注：① 圆形节点代表归经，方形节点代表中药；②图形面积越大连接度越大图1 中药-归经网络图

2.2 左归丸含化合物及对应靶标

山药、枸杞子、川牛膝、菟丝子的成分及靶点信息来源于TCMSP数据库，鹿角胶和龟甲胶来源于BATMAN-TCM数据库，熟地黄来源于TCMSP和BATMAN-TCM数据库。左归丸复方中包含73个化合物537个靶标(见表1)。

表1 左归丸包含中药所含化合物及潜在靶标个数

2.3 骨质疏松相关基因

以“osteoporosis”为检索词，从DisGeNET数据库获得366个靶点基因，从Drugbank数据库中获得50个基因，其中9个基因同存在于该2个数据库，去重后共获得407个可能与骨质疏松相关的靶点基因，与左归丸靶标基因数据库取交集获得51个重复基因(见图2)。DisGeNET、Drugbank、左归丸靶标数据库三者交集3个基因，即ESR1、ESR2、FDPS。

图2 左归丸靶标与骨质疏松基因数据库韦恩图

2.4 左归丸靶标网络分析

Cytoscape3.7.1软件构建左归丸靶标网络，取最大连通片进行分析(见图3)。该网络有118个节点，聚成7个子模块，不同子模块代表功能密切相关蛋白之间相互作用下完成特定的分子功能。左归丸靶标节点主要分布在子模块1、2、3。通过计算受控分衡量左归丸对靶标作用的强弱，即中药-化合物靶向某靶标的数量[16]，网络中共有11个节点的受控分大于或等于5。从靶标网络图可见，受控分排名靠前的节点是PTGS2、PIK3CG、PPARG、AR、BAX等。

注：蓝色节点为骨质疏松疾病基因，红色节点为左归丸治疗骨质疏松的靶标基因；节点大小与受控分数成正比图3 左归丸靶标网络图

2.5 左归丸重要靶标的功能富集分析

将左归丸靶标网络图主要的3个子模块(见图3)节点基因分别输入DAVID中进行功能富集分析。

在DAVID中选择蛋白相互作用(Protein Interactions)功能聚集分析(Functional Annotatin Clustering)，模块1中28个基因，聚成runt相关转录因子1(Runt-related transcription factor 1，RUNX1)、维生素D受体(vitamin d receptor，VDR)及叉头盒蛋白O3(forkhead box protein O3，FOXO3)蛋白之间相互作用网络。模块2中25个基因，聚成血小板衍生生长因子B(platelet derived growth factor subunit b，PDGFB)、血小板反应蛋白(thrombospondin 1，THBS1)、血小板衍生生长因子A(platelet derived growth factor subunit a，PDGFA)等蛋白互作网络；模块3中20个基因，聚成有丝分裂原激活蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、有丝分裂原激活蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)等蛋白互作网络。

在DAVID中选择通路分析(Pathways)中KEGG_PATHWAY分析，3个模块共获得70个信号通路，删除其他疾病通路(如结肠直肠癌、Ⅰ型人T淋巴细胞白血病病毒感染等)，且P-value<1×10-2，共16个信号通路，其中子模块1、2、3分别有4个、5个、7个信号通路(见表2)。

表2 左归丸靶标网络子模块靶标富集的KEGG信号通路比较

3 讨论

随着计算机技术在生命科学中的应用和系统生物学的发展，网络药理学这一研究领域进展迅速，它基于系统生物学、药理学、分子生物学等多学科技术，通过构建“活性成分-靶标-疾病”相互作用网络，探讨药物和疾病之间复杂关系的研究方法[18]。近年来广泛应用于中药方剂配伍规律、中药药效等研究中[19]。

本研究采用网络药理学方法分析了左归丸对骨质疏松的潜在药效机制。首先，基于《药典》中中药及归经信息，构建中药-归经网络；结合疾病基因数据库和中药活性成分及靶点数据库构建靶标网络，预测重要靶标干预的生物学通路，揭示左归丸“补肾壮骨”用药依据和多成分、多靶点分子机制。

中药-归经网络中，左归丸君药熟地黄入肝、肾经，滋肾填精益髓；山药归脾、肺、肾经，养肝滋肾，平补三阴；山茱萸、枸杞子归肝、肾经，补肾益精；龟甲胶归肝、肾、心经，鹿角胶归肝、肾经，二者为血肉有情之品，峻补精髓，5味中药共为臣药；菟丝子归肝、肾、脾经，川牛膝归肝、肾经，二者益肝肾、强腰膝、健筋骨，为佐药。诸药合用，组成入肝肾经为核心的归经网络，为诠释左归丸“补肾壮骨”的科学内涵奠定基础。

左归丸的靶标网络是一个多靶点参与的复杂交错网络，其中PTGS2、PIK3CG、PPARG、AR、BAX等是受控分排名靠前，可能是左归丸的关键靶标。研究显示，PTGS2是前列腺素生成的限速酶，前列腺素可诱导核因子-κβ受体活化因子配体的表达，促进破骨细胞分化[20]；PPARG抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[21]；AR是雄激素受体，雄激素与成骨细胞表面AR结合促进成骨分化[224]；促凋亡因子BAX与骨细胞凋亡相关[23]，可见左归丸可能通过多靶点影响成骨、破骨细胞分化及骨细胞凋亡等发挥治疗作用。

重要靶标的功能富集分析显示，左归丸可能作用于多个信号通路：①靶标网络子模块1主要涉及转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-beta)、雌激素(Estrogen)、甲状腺激素(Thyroid hormone)等信号通路，它们均与成骨分化有关。Thyroid hormone信号通路中甲状腺激素影响碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的表达，从而影响骨钙蛋白和成骨细胞分化[24]；TGF-β信号通路可通过下游Smad通路调节成骨分化和骨形成[25]；Estrogen信号通路可利用雌激素调控骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨分化[26]；②靶标网络子模块2主要涉及磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B,PI3K-Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、Ras相关蛋白1(Ras-related protein 1，Rap1)等信号通路。PI3K-Akt信号通路是调控成骨细胞和破骨细胞功能的信号通路网中心，具有调节成骨细胞和破骨细胞功能的双重作用[279]；MAPK信号通路主要包含细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular regulated kinase 1/2, ERK1/2)、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38、细胞外信号调节激酶5(extracellular signal regulated kinase,ERK5)通路，可激活各自不同的转录因子且相互联系，诱导成骨分化和骨形成[28]；Rap1属Ras超家族小分子量G蛋白，骨组织、骨细胞有RAS分布，一些调控骨代谢的信号分子(如TGF-β) 促进Ras与GTP结合及活化，启动Ras-MAPK磷酸化级联反应，激活ERK1/2，调控下游骨细胞活动[29]；③靶标网络子模块3主要涉及神经营养因子(Neurotrophin)、鞘脂类(Sphingolipid)、破骨细胞分化(Osteoclast differentiation)等信号通路。Osteoclast differentiation通路也与PI3K-Akt、NF-κβ、MAPK等多个信号通路密切相关，调控破骨细胞的分化与成熟；Neurotrophin是神经营养相关信号通路，Sphingolipid是鞘脂类信号通路，它们与骨质疏松的相关性尚不明确。可见，左归丸可能作用于多个信号通路，且不同的信号通路之间还存在广泛的相互作用及复杂的信号传导机制，为左归丸作用机制研究带来巨大挑战。

本研究为提高网络药理学研究方法预测结果的可信度，分别纳入TCMSP、BATMAN-TCM 2个中药数据库和Drugbank、DisGeNET 2个疾病靶点数据库，视数据量大小取两类数据库的交集或并集构建网络。在左归丸靶标筛选中发现，ESR1、ESR2、FDPS在DisGeNET、Drugbank、TCMSP数据库中均有收录，提示它们作为左归丸潜在标靶可信度非常高。ESR1、ESR2编码雌激素受体，介导雌激素发挥生物学作用的核内生物大分子；FDPS是双膦酸盐类药物关键靶点。研究表明，左归丸含药血清能上调成骨细胞MC3T3-E1雌激素受体蛋白表达[30]，能协同唑来膦酸抗骨质疏松[31]。左归丸是否具有雌激素和双膦酸盐样双重作用，在实验研究中值得关注。