高效液相色谱法测定不同柑橘品种新老叶类黄酮含量

程慧林 孙建城 吴群 郑雪良

摘要 [目的]利用高效液相色谱法检测9个不同柑橘品种新、老叶片类黄酮含量，分析各品种新、老叶片类黄酮种类及其含量。[方法]色谱柱为Waters ODS C 18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;以色谱乙腈（溶液A）和含有0.1%甲酸的超纯水（溶液B）为流动相，线性梯度洗脱，流速1 mL/min，柱温25 ℃;检测波长280 nm。[结果]不同柑橘品种新老叶片所含类黄酮组成差异较大，其中葡萄柚主要为柚皮芸香苷和橙皮苷;胡柚以新圣草次苷和橙皮苷为主，椪柑主要为柚皮苷、甜橙黄酮和川陈皮素，新叶类黄酮化合物总量以汪村1号椪柑最高（21.153 mg/g），老叶以汤姆逊粉红葡萄柚最高（14.307 mg/g）。[结论]9个柑橘品种之间，同一品种新、老叶间类黄酮含量和种类存在差异，大部分品种老叶含量和种类多于新叶。

关键词 高效液相色谱;柑橘;类黄酮;含量测定

中图分类号 R284  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）07-0184-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.043

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of Flavonoid Content in New and Old Leaves of Different Citrus Varieties by High Performance Liquid Chromatography

CHENG Hui-ling，SUN Jian-cheng，WU Qun et al

（Quzhou Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Quzhou，Zhejiang 324000）

Abstract [Objective] To determine and analyze flavonoids types and content in new and old leaves of 9 different citrus varieties by high performance liquid chromatograph （HPLC） method.[Method] The separation was carried on Waters ODS C 18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） column kept at 25 ℃ using chromatography acetonitrile （solution A） and ultrapure water containing 0.1% formic acid （solution B） mixture as the mobile phase at a flow rate of 1 mL/min through linear gradient elution and the detection wavelength was set at 280 nm.[Result] The flavonoid composition in the leaves of citrus varieties was quite different.Narirutin and hesperidin were major flavonoids in grapefruit.Neoeriocitrin and hesperidin were major flavonoids in Huyou.Ponkan mainly contained naringin，sinensetin and nobiletin.Wangcun No.1 ponkan was highest of flavonoids content in new leaves with 21.153 mg/g and Thomson pink grapefruit was highest of flavonoids content in old leaves with 14.307 mg/g.[Concusion] There are differences in flavonoids types and content in new and old leaves of 9 different citrus varieties and old leaves higher than new leaves in most varieties.

Key words HPLC;Citrus;Plavonoids;Content determination

柑橘是我國广泛种植的重要水果之一，有着丰富的营养价值和独特的口感风味，深受消费者喜爱。柑橘果实富含类黄酮、酚酸、类胡萝卜素等活性物质，还含有几乎只存在柑橘属中的多甲氧基黄酮，如川陈皮素、橘皮素、橙黄酮等[1]。研究表明，类黄酮具有抗癌、消炎、降血脂、强化毛细血管、抗过敏等作用[2]，除此之外，类黄酮具有广谱的抑菌效果，对黄曲霉、青霉菌、革兰氏阴性菌的生长具有明显的抑制作用[3-5]。目前，柑橘中已经鉴定得到80多种类黄酮，大多数柑橘品种以黄烷酮类和黄酮类为主，少数黄酮醇类、花色素类和多甲氧基黄酮（PMFs）等[2]。类黄酮测定方法主要有高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱联用法（LC-MS），王智聪等[6]用HPLC法对西柚不同组织中的10种柑橘类黄酮化合物进行测定，结果显示柑橘类黄酮化合物在西柚果皮、囊衣和果瓣中的分布不同，含量差异显著。刘晓娟[7]利用HPLC和LC-MS/MS在瓯柑果皮中鉴定得到9种类黄酮，并对类黄酮单体进行了鉴定和代谢规律分析，结果表明，CrOMT1 和CrOMT2具有调控PMFs合成的生物学功能，且在果实发育过程中，黄烷酮类糖苷在油胞层和白皮层的含量均呈下降趋势，PMFs 特异地积累在果实油胞层中，呈先上升后下降的趋势。除柑橘果实外，柑橘叶片、花及根也均富含类黄酮[8]，近年来，柑橘类黄酮的研究多集中在柑橘果实部分，如果皮、果肉和囊衣等，少有对柑橘叶片相关研究报道。该研究选取椪柑、胡柚和葡萄柚等9个不同柑橘品种材料，探讨不同品种柑橘新、老叶片中类黄酮的含量和种类，以期为柑橘类黄酮在医药、保健、食品工业等方面的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材。试验材料来自原衢州市经济特产站十里丰试验基地（后为衢州市农业林业科学研究院），采集时间为2017年7月5日，叶片新叶为采自当年新发出的春梢，从上往下第3片开始采集，老叶为采集新叶枝梢的前1年老熟秋梢，每个品种3棵树，每棵树随机摘取新老叶各10片，混匀，即每个品种新老叶共30片。品种包括派溪头椪柑、和阳椪柑、黄皮椪柑、汪村1号椪柑、罗浮金柑、优株胡柚、胡柚2号、汤姆逊粉红葡萄柚、火焰葡萄柚。类黄酮的测定在浙江大学农业与生物技术学院实验室进行。

1.1.2 试剂。标准品圣草次苷、新圣草次苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、异甜橙黄酮、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素，美国Sigma-Aldrich公司;香风草苷，百灵威生物科技有限公司;5-去甲川陈皮素（5-羟基-6，7，8，3′，4′-五甲氧基黄酮），云南西力生物技术股份有限公司。

1.1.3 仪器与设备。真空浓缩仪（Concentrator plus，Eppendorf，德国）;Agilent高效液相色谱仪（安捷伦，美国）;KQ100DE数控超声波仪（昆山超声仪器有限公司）;Sigma3K15高速冷冻离心机（Sigma 公司，美国）;Millpore超纯水器（Millpore 公司，美国）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备。分别称取柑橘叶片新鲜样品粉末0.1 g，用80%乙醇3 mL超声辅助提取30 min，提取液离心（4 000 r/min，10 min），重复超声提取和离心步骤3次，合并上清（约9 mL），收集在离心管中，提取液利用真空浓缩仪浓缩 5 倍，重新溶解于甲醇中，过0.22 μm 滤膜后用HPLC检测。利用类黄酮标准品进行定性和定量分析。

1.2.2 HPLC色谱条件。采用 Agilent HPLC 系统，以 Waters ODS C 18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）为固定相;以色谱乙腈（溶液 A）和含有 0.1%甲酸的超纯水（溶液 B）为流动相，线性梯度洗脱，洗脱梯度为 0～5 min，20%A;5～10 min，20%～27%A;10～15 min，27%A;15～25 min，27%～40%A;25～35 min，40%～60%A;35～40 min，60%～80%A;40～42 min，80%～100%A;42～45 min，100%～20%A;45～50 min，20%A。检测波长280 nm;柱温25 ℃;进样量10 μL;流速1 mL/min。

2 结果与分析

2.1 类黄酮化合物标准品的色谱图 柑橘水果成分复杂，既有极性较大的糖类、氨基酸类、有机酸和酚酸类，又有极性适中的黄烷酮类和极性较小的多甲氧基黄酮等，同样，在柑橘叶片中也具有多种类黄酮化合物。图1是类黄酮化合物标准品的色谱图，13种化合物分离明显，峰型较好。因9种样品新、老叶都未检测到香风草苷，因此下文类黄酮含量没有体现，特此说明。

2.2 不同柑橘品种新老叶类黄酮总量的比较 从图2可以看出，不同柑橘品种叶片类黄酮含量差异较大。新叶中，9种柑橘叶片类黄酮总量变异范围为未检测出～21.153 mg/g，黄皮椪柑新叶未检测出类黄酮化合物，而汪村1号椪柑类黄酮总量最高，为21.153 mg/g，含有丰富的橙皮苷和川陈皮素;老叶的类黄酮总量有所不同，为0.564～14.307 mg/g，最大和最小分別是汤姆逊粉红葡萄柚和火焰葡萄柚，两者相差25倍，其次是罗浮金柑，类黄酮总量12.594 mg/g，在汤姆逊粉红葡萄柚老叶中，橙皮苷占主要成分，高达13.710 mg/g。新叶类黄酮总量从大到小依次为汪村1号椪柑>胡柚2号>罗浮金柑>优株胡柚>火焰葡萄柚>和阳椪柑>派溪头椪柑>汤姆逊粉红葡萄柚>黄皮椪柑;老叶类黄酮总量从大到小依次为汤姆逊粉红葡萄柚>罗浮金柑>和阳椪柑>优株胡柚>派溪头椪柑>汪村1号椪柑>黄皮椪柑>火焰葡萄柚>胡柚2号。

2.3 不同柑橘品种新叶类黄酮含量和种类比较 从表1可以看出，不同柑橘品种新叶中类黄酮含量和种类各不尽相同。汪村1号椪柑新叶检测出的类黄酮化合物种类最多，也是所有品种含量最高，橙皮苷含量最高，为15.906 mg/g，其次为川陈皮素（4.411 mg/g）、5-去甲川陈皮素（0.340 mg/g）、柚皮芸香苷（0.325 mg/g）和异甜橙黄酮（0.170 mg/g）。优株胡柚新叶中检测出4种类黄酮化合物，分别为圣草次苷、新圣草次苷、柚皮芸香苷和新橙皮苷，未检测到PMFs。火焰葡萄柚、胡柚2号和罗浮金柑新叶只检测到2种类黄酮化合物，分别是柚皮芸香苷和柚皮苷、圣草次苷和橙皮苷、圣草次苷和柚皮苷。汤姆逊粉红葡萄柚、派溪头椪柑、和阳椪柑新叶中分别检测到1种类黄酮化合物，分别为枸橘苷、柚皮苷和橙皮苷。黄皮椪柑新叶未检测任何类黄酮化合物。以上新叶检测出的类黄酮化合物种类中，大多都以黄烷酮类化合物居多，主要有圣草次苷、柚皮芸香苷、柚皮苷和橙皮苷，而PMFs种类较少甚至未检测到，如甜橙黄酮和橘皮素，未在任何柑橘品种检测到。

2.4 不同柑橘品种老叶类黄酮含量和种类比较 从表2可以看出，不同柑橘品种老叶中类黄酮化合物含量和种类也有所不同。优株胡柚老叶中类黄酮种类最多，黄烷酮类和PMFs都有检测到，分别有圣草次苷、新圣草次苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷6种化合物和橘皮素、5-去甲川陈皮素2种PMFs，新圣草次苷、柚皮苷和橙皮苷占主要成分，含量分别是1.323、1.009和1.728 mg/g，但未检测到枸橘苷、异甜橙黄酮、甜橙黄酮、川陈皮素4种类黄酮化合物。其次是罗浮金柑老叶，共检测到5种化合物，圣草次苷含量最高（7.577 mg/g），橙皮苷（4.588 mg/g）其次，新圣草次苷、柚皮芸香苷和柚皮苷含量较少。在9个样品中，除胡柚2号、汤姆逊粉红葡萄柚和火焰葡萄柚外，圣草次苷在其他6个品种都有分布，而柚皮芸香苷虽在6个品种检测到，但胡柚2号、派溪头椪柑和阳椪柑老叶未检测到，而在汤姆逊粉红葡萄柚和火焰葡萄柚老叶含有。与新叶不同的是，黄烷酮类化合物虽然都有检测到，但在老叶中5种PMFs也有品种能检测到，包括甜橙黄酮、橘皮素，分布于椪柑和胡柚中;最少的还是枸橘苷、异甜橙黄酮和5-去甲川陈皮素，都只有单个品种检测到，分别是火焰葡萄柚、派溪头椪柑和优株胡柚。

3 讨论与结论

前人对柑橘类黄酮的研究已有很多报道，主要集中在果实部分，如果实、果皮，也有不少研究不同的柑橘品种，如橙类、柚类和宽皮橘类[9-10]。方波等[11]研究表明，柑橘类黄酮组分和含量与柑橘遗传基因有关，柚果实中类黄酮主要为柚皮苷，葡萄柚果实以柚皮苷和新橙皮苷为主;杂种后代类黄酮累积受其亲本的影响。张玉等[9]研究发现，在宫川温州蜜柑、衢州椪柑、哈姆林甜橙、常山胡柚和蕉柑5种果皮中，常山胡柚类黄酮总量最高，且主要成分为柚皮苷和新橙皮苷，而宫川温州蜜柑和哈姆林甜橙果皮中主要成分为橙皮苷;衢州椪柑和蕉柑果皮中主要成分为橙皮苷和川皮素。

该研究以9种不同品种的柑橘为材料，分析了其新、老叶类黄酮含量和组分变化情况，结果发现，不同柑橘品种叶片所含类黄酮组成差异较大，其中葡萄柚主要为柚皮芸香苷和橙皮苷;胡柚以新圣草次苷和橙皮苷为主，椪柑主要为柚皮苷、甜橙黄酮和川陈皮素，这与李利改等[10]的研究结果有所不同，可能是因为不同品种之间存在的差异。PMFs是柑橘类黄酮的一个特殊分支，其中以川陈皮素、橘皮素和甜橙黄酮比较常见，具有很好的药用价值[12-13]。该试验表明，在9种不同柑橘品种材料中，椪柑中的PMFs含量最为丰富，尤其是在新叶中，几乎只在汪村1号椪柑（4.922 mg/g）当中检测到，而老叶中，除了优株胡柚含有少量的PMFs（0.108 mg/g）外，派溪头椪柑、和阳椪柑、黄皮椪柑、汪村1号椪柑4个品种叶片都有检测到，且以派溪头椪柑叶片含量最多（3.692 mg/g），这与李利改等[10]和张玉等[9]的研究结果一致，由此可以说明，PMFs多存在于宽皮柑橘类当中，开发和利用潜力较大。

我国柑橘属植物类黄酮化合物含量丰富，该试验结果显示，除果实外，柑橘叶片同样含有丰富的类黄酮化合物，但不同品种之间同一品种新老叶间存在差异。9个品种中，新叶类黄酮化合物以汪村1号椪柑含量最高（21.153 mg/g），老叶以汤姆逊粉红葡萄柚（14.307 mg/g）最高，但在类黄酮种类上，大部分品种老叶多于新叶，尤其是派溪头椪柑、和阳椪柑和黄皮椪柑中，PMFs种类和含量上远高于新叶。我国作为柑橘生产大国，每年各生产基地都会因枝条修剪而生产大量的枝叶，往往会作为废弃物粉碎、填埋等處理，然而其叶片含有丰富的类黄酮，如若能加以科学利用，开发提炼功能保健成分，变废为宝，将具有很大的经济价值。

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