锦灯笼果实中一个新的螺甾烷醇型甾体皂苷

2022-04-18李国玉管彤梁昊都闫晶媛徐娜吕邵娃匡海学

中医药学报 2022年4期

李国玉，管彤，梁昊都，闫晶媛，徐娜，吕邵娃，匡海学

(1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江哈尔滨 150076；2.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨 150040)

锦灯笼为茄科植物酸浆PhysalisalkekengiL.干燥的宿萼或带果实的宿萼，民间常称其红姑娘果、洛神珠、泡泡草、挂灯笼、灯笼果等[1]。最早收录于《神农本草经》，名酸酱，被列为中品。2020年版《中国药典》载有锦灯笼，其性寒，归肺经，具有清热解毒、利咽化痰、利尿通淋等功效，用于治疗痰热咳嗽、咽痛喑哑、小便不利、外治天疱疮、湿疹。锦灯笼果实还是药食两用的佳品，常被称为“草本水果”，集药用价值、经济价值、观赏价值、营养价值为一体[2]。自二十世纪60年代开始，已经有学者开始对锦灯笼的化学成分进行研究，至今已从锦灯笼中分离鉴定出甾醇类、酸浆苦素类、黄酮类、生物碱类、有机酸类、多糖类、挥发油类等多种化学成分[3]。本文借鉴已有的研究基础，采用硅胶色谱法、薄层色谱法、PHPLC等方法以挖掘丰富锦灯笼药效物质的化学基础为目标，对锦灯笼果实75%乙醇提取物进行化学成分分离，从中得到7个单体化合物，分别鉴定为：(1)23-羟基-吉托皂苷元-3-O-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-半乳糖苷(23-hydroxy-gitogenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside)；(2)26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β,20α,26-三醇-25(R)-Δ5,22-二烯-呋甾-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷；(3)3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖-常春藤皂苷元-28-O-(4-O-乙酰基)-α-L-鼠李吡喃糖-(1→4)-β-D-葡萄吡喃糖-(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖苷；(4)2α,3β-二羟基-5α-孕甾-16-乙二胺-20-酮-3-O-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-半乳糖苷；(5)Ginsenine；(6)蔗糖；(7)麦芽糖。其中化合物1为新化合物，化合物2～5、7为从该植物中首次分离得到(部分结构见图1)。

1 实验材料

制备色谱柱(大连依利特公司)；薄层层析硅胶 G/GF254(青岛海洋化工厂分厂)；AB-8型大孔树脂(廊坊淼阳化工有限公司)；聚酰胺(路桥四甲生化塑料厂)；二氯甲烷等分析纯试剂。

图1 部分化合物的化学结构

中药锦灯笼购于哈尔滨三棵树药材市场，经哈尔滨商业大学药学院中药教研室李国玉教授鉴定为茄科多年生草本植物酸浆[PhysalisalkekengiL.]，原植物标本JDL20170821104储存于哈尔滨商业大学药学院生药实验室。

2 提取与分离

取干燥的锦灯笼果实20 kg，分别用8～10倍量的75%乙醇回流提取2次，每次2 h，回收醇提液并过滤。将过滤后的醇提液合并，进行减压回收，得到浸膏3.26 kg。然后经AB-8大孔吸附树脂，依次经蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇及95%乙醇洗脱，分别得到锦灯笼75%乙醇提取物的水洗脱组分200 g、30%乙醇洗脱组分170 g、70%乙醇洗脱组分163 g和95%乙醇洗脱组分37 g。取70%乙醇的果实提取物85 g，经硅胶柱层析及薄层层析方法对化合物进行分离，二氯甲烷-甲醇(20∶1→1∶1)梯度洗脱，分离得到4个组分(F1～F4)。取F1组分通过硅胶色谱，二氯甲烷-甲醇(15∶1)洗脱，利用薄层色谱(TLC)检识，合并所含成分相似的组分，得到4个组分(F1-1→F1-4)。取F1-2(3.6 g)组分通过硅胶色谱，二氯甲烷-甲醇(13∶1)洗脱，利用TLC检识合并所含成分相似的组分，得到两个组分(F1-2-1→F1-2-2)。取F1-2-2(1.6 g)组分通过硅胶色谱，二氯甲烷-甲醇(8∶1)洗脱，利用TLC检识合并所含成分相似的组分，得到两个组分，其中F1-2-2-2为化合物5(5.6 mg)。取F1-4(3.2 g)组分通过硅胶色谱，二氯甲烷-甲醇(8∶1)洗脱，操作同上，得到3个组分(F1-4-1→F1-4-3)，再取F1-4-2(1.0 g)进行PHPLC等度洗脱(55%甲醇水)，得到化合物2(5.0 mg)。取F2(17.0 g)组分通过硅胶色谱，二氯甲烷-甲醇(8∶1)洗脱，合并后得到4个组分(F2-1→F2-4)。取F2-1(2.8 g)组分通过硅胶色谱，二氯甲烷-甲醇(6∶1)洗脱，F2-1-2为化合物3(5.9 mg)。取F2-4(4.7 g)组分通过硅胶色谱，二氯甲烷-甲醇(5∶1)洗脱，最后共得到两个组分(F2-4-1→F2-4-2)，将其中的F2-4-2组分同样进行PHPLC等度洗脱(60%甲醇水)，得到化合物4(5.8 mg)。取F3(10 g)组分通过正相硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇(4∶1)洗脱，合并后，得到两个组分(F3-1、F3-2)，将F3-1组分采用PHPLC等度洗脱(68%甲醇水)，得到化合物1(5.4 mg)。取70%醇提取部位45 g，加热浓缩至干燥(膏状)，再加入适量的水将会干的物质溶解稀释，在稀释液中加入等体积的正丁醇，萃取2次，合并萃取液，水相中有柱状晶体析出，得到化合物6。取正丁醇部分(16.8 g)通过硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇(45∶1→15∶1)梯度洗脱，再利用TLC检识，合并所含有成分中相似的组分，得到4个组分(Fa-1→Fa-4)。取Fa-3组分，二氯甲烷-甲醇(15∶1→5∶1)梯度洗脱，得到化合物7。

3 结构鉴定

化合物1：白色无定形粉末，溶于甲醇、乙醇及水，Molish反应呈阳性， Liebermann-Burchard反应呈阳性，与E试剂反应呈阴性。HR-ESI-MSm/z:772.4218[M]+，该化合物分子量为772，经酸水解检出D-半乳糖及D-葡萄糖。1H-NMR (C5D5N,400 MHz)δ5.27(1H,d,J=7.8 Hz, Glc-1)和4.91 (1H,d,J=7.8 Hz,Gal-1)处可观察到归属于糖部分的2个端基氢信号；归属于螺甾烷苷元母核的4个角甲基的质子氢信号分别为0.63(3H，s,18-CH3)，0.97(3H，s,19-CH3)，1.17(3H,d,J=7.0 Hz,21-CH3),0.70(3H,d,J=6.5,27-CH3)。13C-NMR (C5D5N，100 MHz)δ60-110之间可观察到半乳糖(103.4, 73.1, 75.8, 80.1, 75.9, 60.9)和葡萄糖(107.1, 75.2, 78.7, 72.2, 78.5, 63.1)的4—1连接的双糖碳信号，70.4, 84.6和81.6分别归属母核的2, 3和16位，根据文献[4]中3位糖苷化的吉托皂苷元比较发现，化合物1的22位(111.7), 23位(67.4)和24位(38.7)的化学位移较吉托皂苷元(gitogenin:109.3-22,31.8-23, 29.3-24)分别变化了+2.4，+35.6和+9.4，表明吉托皂苷元的23位有含氧取代，与文献[5]中化合物2的母核23-hydroxy-5α-spirostan的F环碳谱数据一致，因此确定该化合物苷元为23-羟基-吉托皂苷元。

综上，再结合文献[4-6]及相关谱(见图2)，确定化合物的结构为23-羟基-吉托皂苷元-3-O-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-半乳糖苷(23-hydroxy-gitogenin-3-O-β-D- glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside)。经过SCIfinder数据库检索该化合物为新化合物，具体的NMR数据归属见表1。

表1 化合物1的13C-NMR数据 (C5D5N，JHz)

图2 化合物1的HMBC相关图

化合物2：白色无定形粉末，溶于甲醇、乙醇，Moli-sh反应呈阳性，Liebermann-Burchard反应呈阳性，与E试剂反应呈阳性。HR-ESI-MSm/z:1029.5298[M-H2O+H]+, 867.4691[M-H2O-162+H]+, 721.4163[M-H2O-162-146+H]+,575.3564[M-H2O-146-146-162+H]+, 413.3067[M-H2O-146-146-162-162+H]+,分子式C51H82O22，经过酸水解检出L-鼠李糖，D-葡萄糖。1H-NMR (C5D5N,400 MHz)δ4.86(1H, d,J=8.0), 4.94 (1H, d,J=6.6), 5.86 (1H, s), 6.41 (1H, s), 0.84(3H, s, 18-CH3), 1.03(3H, s, 19-CH3), 1.39(3H, s, 21-CH3), 1.07(3H, d,J=6.6 Hz, 27-CH3), 1.62(3H, d,J=6.1 Hz), 1.78(3H, d,J=6.2 Hz)。13C-NMR数据见表1。结合1D，2D-NMR数据，上述波谱数据与文献[7]报道比对基本一致，故鉴定该化合物为26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β,20α,26-三醇-25(R)-Δ5,22-二烯-呋甾-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物3：白色无定形粉末，溶于甲醇，Lieberman-Burchard反应阳性， Molish反应阳性，Negative-ESI-MSm/z:1115.8[M-H]-, 1151.8[M+2H2O-H]-，该化合物分子量为1116，经酸水解检出L-阿拉伯糖，D-葡萄糖和L-鼠李糖。1H-NMR (C5D5N,400 MHz)δ4.79 (1H, d,J=7.2 Hz, Ara H-1), 6.23 (1H, d,J=8.0 Hz, Glc H-1), 4.96 (1H, d,J=7.8 Hz, Glc H-1′), 5.85 (1H, s, Rha H-1), 1.70 (3H, d,J=6.2 Hz, Rha -CH3), 2.04 (3H, s, OAc-CH3), 5.40 (1H, brs, H-12), 0.88 (3H, s, H-24), 0.91 (3H, s, H-25), 1.08 (3H, s, H-26), 1.23 (3H, s, H-27), 0.85 (3H, s, H-29), 0.88 (3H, s, H-30)。13C-NMR数据见表1。上述波谱数据与文献[8]报道比对基本一致，故鉴定该化合物为已知化合物3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖-常春藤皂苷元-28-O-(4-O-乙酰基)-α-L-鼠李吡喃糖-(1→4) -β-D-葡萄吡喃糖-(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖苷。

化合物4：白色无定形粉末，溶于甲醇，Molish反应阳性，Lieberman-Burchard反应阳性，ESI-MSm/z:679 [M+Na]+，该化合物分子量为656，经酸水解检出D-半乳糖和D-葡萄糖。1H-NMR (C5D5N,400 MHz)δ4.92(1H, d,J=7.8 Hz, Gal H-1), 5.27 (1H, d,J=7.7 Hz, Glc H-1), 6.57 (1H, m, H-16), 0.87 (3H, s, H-18), 0.70(3H, s, H-19), 2.22 (3H, s, H-21)。13C-NMR数据见表1。上述波谱数据与文献[9]报道比对基本一致，故鉴定该化合物为已知化合物2α,3β-二羟基-5α-孕甾-16-乙二胺-20-酮-3-O-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-半乳糖苷。

化合物5：淡黄色结晶性粉末，Molish反应呈阴性，碘化铋钾显色呈桔红色，Positive-ESI-MSm/z:249.2[M+H2O+H]+,该化合物分子量为230。1H-NMR (DMSO-d6, 400MHz)δ4.52(1H, d,J=6.6 Hz, H-3), 3.62(1H, dd,J=12.0, 4.8 Hz, H-6), 3.16(1H, ddd,J=15.2, 4.8, 1.5 Hz, H-7a), 2.78(1H, ddd,J=15.2, 12.0, 1.5 Hz，H-7b), 7.45(1H, d,J=7.8 Hz，H-10), 7.00(1H, dt,J=8.0, 1.0 Hz, H-11), 7.08(1H, dt,J=8.0, 1.0 Hz, H-12), 7.34(1H, d,J=8.0 Hz, H-13), 1.63(3H, d,J=6.7 Hz, H-15)。13C-NMR数据见表1。上述波谱数据与文献[10]报道比对基本一致，故鉴定该化合物为Ginsenine。

化合物6：柱状结晶，Molish反应呈阳性，经与蔗糖对照品共薄层，二者显相同颜色斑点，且Rf值一致，ESI-MSm/z:341.2[M-H]-。1H-NMR(400MHz)中，仅在5.17(1H, d,J=3.4 Hz)处观察一个端基质子。13C-NMR(100MHz)中，δ104.8和93.0有2个端基碳信号，上述波谱数据与文献[11]报道比对基本一致，故鉴定该化合物为蔗糖。

化合物7：白色粉末，Molish反应呈阳性，经与麦芽糖对照品共薄层，二者显相同颜色斑点，且Rf值一致，故鉴定该化合物为麦芽糖。