地黄饮子对APP/PS1小鼠工作记忆及海马超微结构影响的研究

李全，张健，王琪，周妍妍*

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)即老年性痴呆，是一种以认知功能障碍进行性加重为临床表现的退行性神经病[1-2]，其病理改变主要以β-淀粉样蛋白(amyloid-β, Aβ)沉积、Tau蛋白过度磷酸化所导致的神经纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)为特征[3]。中医认为肾精亏虚、痰蒙脑窍是AD的基本病机，地黄饮子出自《黄帝素问·宣明论方》，有补肾、化痰、开窍之功用，现代临床、实验研究发现地黄饮子防治神经退行性疾病有着显著的疗效[4]。课题组前期实验研究证实地黄饮子APP/PS1双转基因痴呆小鼠具有提高学习记忆能力、抑制氧化应激[5]及神经炎症等作用[6]，为进一步探讨地黄饮子对APP/PS1双转基因痴呆小鼠工作记忆及海马超微结构的影响，故而进行了本次实验研究。

1 实验材料

1.1 实验动物

选取6月龄的雄性APP swe/PS1dE9双转基因痴呆小鼠60只，体质量(25±4)g，同月龄同背景的阴性小鼠30只，体质量(23±5)g，购自常州卡文斯实验动物有限公司(江苏)，编号：SCXK(苏)2016-0010，于室温(22±3)℃、相对湿度(45±5)%的SPF级实验动物饲养室中适应性饲养，自由饮食、自由饮水。

1.2 实验药物

地黄饮子药物组成：熟地黄、山茱萸、肉苁蓉、石斛、麦冬、五味子、石菖蒲、远志、茯苓、肉桂、炮附子和巴戟天各20 g，生姜、大枣、薄荷各5 g，由黑龙江中医药大学附属第一医院提供，将上述饮片浸泡1 h、煎煮1 h后滤出药液,再次加水煎煮1 h，将2次药液混合分装, 4 ℃冷藏备用。

1.3 主要实验试剂及设备

多聚甲醛、戊二醛(北京雷根)；盐酸戊巴比妥钠(上海斯信)；甲苯胺蓝(美国SIGMA)。Y迷宫、Su-P erMaze行为学测试软件(上海欣软)；透射电镜(日本HITACHI)；倒置光学显微镜(日本NIKON)；超薄切片机(德国LEICA)。

2 实验方法

2.1 动物分组及给药

2.2 Y迷宫实验

Y迷宫行为学测试于实验第1、2、3个月地黄饮子或蒸馏水灌胃结束后进行。正式实验开始前进行适应性训练，将小鼠放入迷宫中央区任其自由活动8 min，每只小鼠活动结束后用75%消毒酒精喷撒宫臂以消除小鼠气味，适应周期为1 d。正式实验时，将小鼠头部朝向起始臂末端挡板，将其放入起始臂自由探索8 min，同时记录进臂总次数；计算小鼠正确自发交替率，小鼠身体完全进入宫臂记为有效进臂次数，每3次进入不同的宫臂则记为一次正确的自发交替，自发交替率=[正确进臂次数/(总进臂次数-2)]×100%，试验周期为1 d[7]。

2.3 透射电镜检测

透射电镜检测于行为学实验结束后进行，从各实验月份的空白组、模型组、地黄组随机选取3只小鼠，以1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，以4%多聚甲醛(pH=7.4)、生理盐水心脏灌流至肝脏变为白色，断头取脑并依照脑立体定位图谱剥离海马后放入2.5%戊二醛中下固定2 h，将海马组织样本修饰成1 mm3小块，丙酮梯度脱水、包埋、半薄切片处理后甲苯胺蓝染色，倒置光镜定位后制作超薄切片,经醋酸双氧铀、枸椽酸铅双染色[8]，透射电镜1 200～4 000倍观察小鼠海马CA1区神经细胞超微结构并抓拍照片。

2.4 统计学分析

应用SPSS 23.0统计软件将所得数据处理分析，数据结果以均数±标准误表示，对实验所得数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05认为差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 地黄饮子对APP/PS1小鼠自发交替率的影响

3.1.1 实验第1个月地黄饮子对APP/PS1小鼠自发交替率的影响

实验第1个月的各组小鼠进臂总次数无差异，不具有统计学意义(P>0.05)；与B1组相比，M1组小鼠正确自发交替率显著降低，具有统计学意义(P<0.01)；与M1组相比，D1组小鼠正确自发交替率显著提高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 给药1个月Y迷宫测试结果比较

3.1.2 实验第2个月地黄饮子对APP/PS1小鼠自发交替率的影响

实验第2个月的各组小鼠进臂总次数无明显差异，不具有统计学意义(P>0.05)；与B2组相比，M2组小鼠正确自发交替率显著降低，具有统计学意义(P<0.01)；与M2组相比，D2组小鼠正确自发交替率显著提高，具有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 给药2个月Y迷宫测试结果比较

3.1.3 实验第3个月地黄饮子对APP/PS1小鼠自发交替率的影响

应做到真正合理有效的利用现有的资源，结合水利信息工程建设自身的特点，有针对性地制订与其相关的标准，逐步实现水利信息化建设的标准。

实验第3个月的各组小鼠进臂总次数无明显差异，不具有统计学意义(P>0.05)；与B3组相比，M3组小鼠正确自发交替率显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与M3组相比，D3组小鼠正确自发交替率显著提高，具有统计学意义(P<0.01)，见表3。

此外，M3组与M1组小鼠相比正确自发交替率显著降低，具有统计学意义(P<0.01)，M3组与M2组小鼠相比正确自发交替率显著降低，具有统计学意义(P<0.05)，而各给药月份地黄组小鼠正确自发交替率无明显差异，不具有统计学意义(P>0.05)。

表3 给药3个月Y迷宫测试结果比较

3.2 地黄饮子对APP/PS1双转基因小鼠不同时期病理特征的影响

3.2.1 实验1个月地黄饮子对APP/PS1小鼠病理特征的影响

镜下观察B1组小鼠海马CA1区可见神经细胞数目较多、结构完整、分布密集，见图1A。与B1组相比，M1组海马CA1区神经细胞结构相对完整，但内质网减少且伴有不同程度的扩张，线粒体肿胀，线粒体嵴呈畸形样改变，镜下观察细胞电子密度不均，散见少量的溶酶体与脂褐素，见图1B。与M1组相比，D1组海马CA1区神经细胞结构完整，线粒体轻度肿胀，结构相对完整，形态较为规则，见图1C。

3.2.2 实验2个月地黄饮子对APP/PS1小鼠病理特征的影响

至实验第2个月，B2组小鼠海马CA1区神经细胞器结构完整，见图1D。M2组与B2组相比小鼠海马CA1区神经元细胞染色质边集，可见细胞凋亡现象，见图1E。而地黄饮子组小鼠海马CA1区神经细胞数量较多且分布密集，结构完整，可见少数脂褐素，见图1F。

3.2.3 实验3个月地黄饮子对APP/PS1小鼠病理特征的影响

至实验第3个月，B3组小鼠海马CA1区少数线粒体轻度肿胀，镜下可见散在少量溶酶体，见图1G。与B3组相比，M3组小鼠海马CA1区神经细胞破裂、分散，细胞固化萎缩后可见凋亡小体，内质网减少且伴有不同程度的扩张，线粒体肿胀、破裂，溶酶体与脂褐素并见，见图1H。而D3组小鼠CA1区线粒体形态结构规则，与空白组神经元细胞镜下形态已较为接近，见图1I。

图1 各实验月份各组小鼠海马CA1区超微结构

4 讨论

AD是一种起病隐匿并且呈进行性发展的神经系统退行性疾病，AD病在中医上被归为“痴呆”“呆症”范畴，肾精亏虚，痰蒙脑窍是其基本病机，经典名方地黄饮子在方剂学中被归为阴阳双补之剂[9]，具有补肾、化痰、开窍之功效，符合AD的中医发病机制，无论是古代医家还是现代医家运用地黄饮子防治老年性痴呆都有着显著疗效，故本实验选用地黄饮子探讨其对APP/PS1双转基因痴呆小鼠工作记忆及海马超微结构的影响。

通过对Y迷宫实验结果的分析发现，各实验月份的各组小鼠的进臂总次数并无明显差异(P>0.05)，说明小鼠视力及运动能力正常，排除体力及视力对小鼠探索迷宫的影响。随着实验月份的增加，模型组APP/PS1小鼠自发交替率逐渐降低，尤其是M3组与M1、M2组相比，APP/PS1小鼠工作记忆能力显著降低；而经地黄饮子干预的APP/PS1小鼠自发交替率逐渐上升，这表明地黄饮子能够提高APP/PS1小鼠的工作记忆能力，并且随着给药时间的增加呈逐渐上升的趋势。

本课题组基于前期HE染色、尼氏染色、免疫荧光染色等实验[10]，探讨了光镜下APP/PS1小鼠海马区的病理改变，为进一步观察APP/PS1小鼠海马区的超微结构改变，本实验采用了透射电镜呈像技术。经透射电镜镜下观察显示，随着实验月份的增加，模型组小鼠海马CA1区线粒体逐渐发生肿胀、变形、破裂，神经细胞出现凋亡现象，并随着小鼠月龄的增加凋亡小体逐渐增多；而经地黄饮子干预的APP/PS1小鼠海马CA1区线粒体只是轻度肿胀，同时神经细胞也未发生凋亡现象，并且随着给药时间的增加神经细胞形态结构已与空白组相接近。此外，本研究还发现在B3组小鼠海马CA1区线粒体出现了轻度的肿胀、变形的改变，这表明即使是阴性空白组小鼠也会随着月龄的增长线粒体结构出现改变，而地黄饮子能够显著保护神经细胞，抑制细胞的凋亡，改善线粒体形态结构，这与课题组既往研究[11]的地黄饮子含药脑脊液可减轻细胞的受损程度，提高细胞活力，抑制细胞凋亡的实验结果相符。

综上，各实验月份的各组小鼠的病理学改变与行为学改变相一致，APP/PS1小鼠随着月龄增加工作记忆能力呈进行性下降，线粒体发生肿胀变形，并且至小鼠9月龄时出现大量的凋亡小体；地黄饮子可改善APP/PS1小鼠随月龄增长而下降的工作记忆能力，并抑制神经细胞凋亡，改善线粒体形态结构。