MMS21通过维持MCM2-7复合物稳定性促进肝细胞癌增殖活性

李文佳，朱元昕，胡开顺

（中山大学孙逸仙纪念医院基础与转化医学研究中心//广东省恶性肿瘤表观遗传与基因调控重点实验室，广东广州 510080）

肝癌是世界第六大常见的恶性肿瘤。在中国，肝癌更是位列肿瘤相关死亡原因第二位；其中，85%～90%属于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。早期诊断率低、有效治疗药物的缺乏、术后易复发等，是导致肝癌患者预后差的主要原因［1］。因此，深入研究肝癌形成及进展的分子机制，寻找新的诊断及治疗靶点，仍然是目前肝癌研究的重要内容。SUMO E3连接酶MMS21（NSMCE2），结构上包含两种染色体结构维持蛋白（Smc5/6）和一个Siz/PIAS（激活信号转导蛋白抑制剂和转录激活因子）RING 结构域，具有E3 连接酶活性并参与Small Ubiquitin-like Modifier（SUMO）进程。当E3 连接酶MMS21 的SUMO 活性被破坏时，会导致不同的表型，如DNA 损伤、核仁完整性和端粒聚集缺陷等［2］。MMS21 作为SMC5/6 复合体的亚基，同时也是停滞叉蛋白质组的关键组成部分，能拮抗基因组不稳定［3］。Zhao［2］和Branzei 等［4］发现在芽殖酵母中，MMS21 的缺失是致命的，虽然缺失其部分SUMO活性不完全致死，但造成复制相关DNA 修复缺陷。Richard 等［5］证明MMS21 通过维持DNA 修复、平衡转录和基因组稳定性等在植物发育过程起到至关重要的作用。Kelvin 等［6］发现MMS21 是复制应激修复反应的基因产物，是细胞有效拯救折叠的复制叉以完成DNA 合成所必需的。然而MMS21在肝癌中的功能与作用机制尚未报道，我们将对此问题进行全面探讨，以期为肝癌的诊断和治疗提供新的靶点和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

表达载体pLVX-DsRed-Monomer-N1（Clontech，632152），胎牛血清（LONSERA，S712-012），总RNA 提取试剂盒（ESscience，RN001），逆转录试剂盒（TaKaRa，RR047A-1），SYBR Green qPCRMix（TaKaRa，RR820），ECL 化学发光底物（Vazyme，E412-01-AA），高保真酶（TaKa-Ra，R040），限制性内切酶BamH1（Thermo Scientific，ER0051），Xho1（Thermo Scientific，ER0691），GeneJET PCR 纯化试剂盒（Thermo Scientific，K0702），T4 连接酶（Thermo Scientific，EL0014），粘附载玻片（CITOTEST，80312-3161），显微镜盖玻片（CITOTEST，80340-3610），快速银染试剂盒（Beyotime，P0017S），RNase（AG，A3A0336），PI（Beyotime，ST511），Lipofectamine®RNAiMAX（Thermo Scientific，13778150），anti-BrdU（ABclonal，A1482），DAPI（Beyotime，C1002），Goat anti-Mouse IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody，Alexa Fluor 488（Thermo Scientific，A11001），anti-IdU（Origene，TA190129），anti-BrdU（Abcam，ab6326），Goat anti-Rat IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody，Alexa Fluor 555（Thermo Scientific，A-21434），anti-MYC（Servicebio，GB12076），anti-Tubulin（TransGen Biotech，HC101-01），anti-Cyclin A2（CST，4656T），anti-Cyclin B1（CST，4138T），anti-Cyclin D1（PTG，60186-1-Ig），anti-Cyclin D3（CST，2936T），anti-Cyclin E1（PTG，11554-1-AP），anti-MCM2（BD，610700），anti-MCM3（PTG，15597-1-AP），anti-MCM4（PTG，13043-1-AP），anti-MCM5（PTG，11703-1-AP），anti-MCM6（BD，611622），anti-MCM7（PTG，11225-1-AP），anti-NSE2/MMS21（Santa，sc-51747）。

1.2 细胞培养

SK-hep1、Huh7、HepG2、SNU-182 和LO2 细胞均来自中科院上海细胞库，细胞在37 ℃和5% CO2的培养箱中使用含有10%的FBS 高糖DMEM 培养基培养。

1.3 PCR扩增MMS21

以SK-hep1 全基因组cDNA 为模板，高保真酶扩增目的基因。反应条件为：98 ℃5 min；98 ℃10 s；55 ℃5 s；72 ℃1 min，进行35 个循环。将PCR 产物进行电泳检测，取正确大小的胶带进行回收纯化。纯化后的产物用BamH1 和XhoI 内切酶37 ℃反应1 h 后，纯化片段，并用T4 连接酶将其连接到同样酶切过后的Plvx表达载体中，通过大肠杆菌转化涂板，挑选出单克隆菌落，测序鉴定。MMS21 PCR扩增引物：F（含MYC标签）：CCCTCGAGATGGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGAT -GCCAGGACGTTCCAGTTC；R：CGGGATCCTCCTA CTCGGAATGACGATGTC。

1.4 免疫沉淀与质谱

采用10 cm 大皿扩增Plvx-MYC-MMS21 和Plvx-MYC-Vector 细胞，待细胞长到85%，去除上清，用1 mL 含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的NETN buffer（20 mmol/L Tris-HCl［pH 8.0］，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA and 0.5% Nonidet P-40）裂解液将细胞在冰上裂解30 min 并收集［7］。再用4 ℃15 000×g高速离心机去除细胞碎片沉淀，收集上清。在上清中加入用NETN buffer 清洗过三次的MYC标签的琼脂糖珠，置于4 ℃冰箱摇床孵育过夜。将琼脂糖珠-抗体-蛋白的混合物清洗三次，取90%样品进行银染及质谱分析，10%样品在98 ℃高温变性10 min，置于8%SDS-PAEG电泳胶。

1.5 DNA Fiber

在细胞密度70%～85%时，CIdU（50 μmol/L）处理20 min 后，用PBS 洗两次，用IdU（500 μmol/L）处理20 min，用胰酶消化细胞并收集于1.5 mL EP 管中离心，用预冷的PBS 重悬细胞沉淀，置于冰上30 min，将1 μL 细胞滴在载玻片静置片刻，待液滴边缘干燥时，加入裂解液7 μL并静置2 min，再将载玻片倾斜（20°～40°角）使液滴缓慢流下，待玻片风干后，固定并变性90 min，用PBS 洗3 min，用免疫荧光封闭液封闭30 min，加入一抗BrdU（Rat）/IdU（M）于4 ℃孵育过夜。第二天用PBST 清洗3 次，每次3 min，荧光二抗Goat anti-Rat IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody，Alexa Fluor 555 和Goat anti-Mouse IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody，Alexa Fluor 488 混合液常温孵育1 h，用PBST 洗3 次后，载玻片依次用75%、95%和无水乙醇脱水。载玻片用盖玻片封片后，在具有63倍物镜的激光共聚焦显微镜下成像。

1.6 流式细胞术

细胞用siRNA 处理48 h后，用胰酶将细胞消化收集在1.5 mL EP 管中，常温120×g低速离心机离心，细胞沉淀用预冷的PBS 清洗1 次后，用1 mL 预冷的PBS 和75%酒精混合物（1：9）重悬细胞沉淀。单细胞悬浮液在4 ℃固定过夜后，离心去上清，避光加入1 mL RNase 和PI 混合液（RNase 工作浓度2 μg/mL，PI 工作浓度50 μg/mL）并避光孵育30 min。处理后的单细胞悬浮液置流式管中，使用流式细胞仪测定，数据采用ModFit LT 5.0软件进行分析。

1.7 定量PCR

总RNA 提取、反转录、qPCR：均使用购自Takara的提取，反转录、qPCR 试剂盒，参照说明书操作。β-actin 的qPCR 引物F：5’-TCATGAAGTGTGACGTGGACAT-3’，R：5’-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’；MMS21 的qPCR 引 物F：5-ATGCCAGGACGTTCCAGTTC-3’，R：5’-CCATACCAGA GTTGATACA GGCT-3’。

1.8 细胞siRNA转染

在细胞密度40%～50% 时，进行细胞siRNA（small interference RNA）干扰。具体实验步骤如下：分别将5 μL Lipofectamine®RNAiMAX 试剂用150 μL Opti-MEM 培养基稀释成混合液（1），30 pmol siRNA 用150 μL Opti-MEM 培养基稀释成混合液（2）。再将混合液（2）加入混合液（1）中，室温孵育5 min 后，加入细胞培养皿中。细胞在37 ℃和5% CO2的培养箱中继续培养48 h。MMS21 siRNA序列如下：siMMS21#1：5’-UUCAACCAUUGCCUUGUCCTT-3’，siMMS21#2：5’-GACUGAAGUGAG UAGUGAAdTdT-3’。

1.9 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行数据统计分析，GraphPad Prism 8.0 软件作图。组间数据平均值比较采用Student′st-test检验。

2 结果

2.1 MMS21 在肝细胞癌中高表达且与预后不良相关

为了阐述MMS21 在肝癌发生发展中的作用，我们首先分析了MMS21在HCC 中的mRNA 表达水平。Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA）（http：//gepia.cancer-pku.cn/）的数据显示，与160 例癌旁组织（N）相比，369 例肝细胞癌组织（T）中的MMS21 表达显著上调（图1A）。同时在数据库clinical proteomic tumor analysis consortium（CPTAC）（https：//proteomics.cancer.gov/programs/cptac）中，对比HCC的癌旁组织，MMS21（NSMCE2）在肝癌组织中的蛋白水平也呈现高表达（图1B）。值得注意的是，MMS21 的高表达与肝癌患者的不良预后相关（图1C）。接下来，我们收集了正常肝细胞系LO2 和4 个肝癌细胞系（Huh7、SK-hep1、HepG2 和SUN-182）以做进一步的证明。通过qPCR 和Western blot 分别检测mRNA 和蛋白表达水平，结果显示肝癌细胞系中MMS21 的mRNA 和蛋白表达明显高于正常肝细胞系（图1D）。综上所述，MMS21与肝癌的恶性进展密切相关。

图1 MMS21在肝细胞癌中高表达且与患者预后不良相关Fig.1 MMS21 was upregulated in HCC tissues and associated with poor prognosis

2.2 沉默MMS21阻碍肝癌细胞G1-S期的转换

接下来，为证明MMS21 在肝癌增殖中的重要作用，我们分别敲低肝癌细胞SK-hep1 和HepG2中的内源性MMS21 蛋白表达来进行功能缺失实验（图2A）。细胞周期分析显示，在MMS21 敲低的SK-hep1 细胞中G1 期比例增加，S 期比例减少，G2/M 期的比例减少；同样在HepG2 细胞中，敲低内源性MMS21 后，G1 期细胞比例增加，S 期细胞比例减少，G2/M 期细胞的比例减少（图2B、2C）。

图2 沉默MMS21阻碍肝癌细胞G1-S期的转换Fig.2 MMS21 silence blocks the G1-S phase transition in HCC cells

2.3 沉默MMS21抑制肝癌细胞的增殖

为进一步探讨肝细胞癌中MMS21 的促增殖作用，我们利用BrdU和克隆形成试验来评估MMS21对肝癌细胞SK-hep1和HepG2细胞增殖能力的影响。如 图3A、3 所 示，在MMS21 敲低的SK-hep1 和HepG2 细胞中，SK-hep1 细胞增殖能力和克隆形成能力显著降低。在HepG2 细胞中也得到了一致结论，敲低内源性MMS21后细胞的增殖能力显著下降。

图3 沉默MMS21抑制肝癌细胞的增殖Fig.3 Depletion of MMS21 inhibits HCC cells proliferation

2.4 沉默MMS21减慢DNA复制叉的速度

我们进行了DNA Fiber 实验以研究敲低MMS21 后对细胞复制叉动力学的影响，以进一步明确MMS21 调控肝细胞癌增殖的分子机制。与对照细胞（～1.154 kb/min）相比，敲低MMS21 的细胞中表现出平均复制速度（～0.844 kb/min 和～0.9125 kb/min）显著降低。这些结果表明MMS21在肝癌细胞的DNA复制过程中发挥十分重要作用（图4）。

图4 沉默MMS21减慢DNA复制叉的速度Fig.4 MMS21 knockdown reduces the DNA replication-fork speed

2.5 MMS21互作蛋白组聚类分析

我们以上数据表明，MMS21 在肝癌细胞的增殖中发挥着重要作用。为了更深入地了解MMS21在HCC 形成中的潜在机制，我们采用质谱蛋白质组学来鉴定MMS21的下游靶蛋白。在稳定过表达MMS21 的SK-hep1 细胞中，Co-IP 后的银染结果提示，与对照组相比，有较多差异蛋白存在（图5A、5B）。进一步，我们通过质谱鉴定了MMS21的互作蛋白质组。对比对照组和实验组质谱数据，鉴定出与MMS21 特异结合的641 个蛋白（图5C）。通过对641 个互作蛋白进行GO（Gene Ontology）分析，显示MMS21 及其互作蛋白参与蛋白翻译、定位、折叠，线粒体翻译以及免疫反应等细胞过程，同时利用3.6.3 Cytoscape 分析软件，进一步对与MMS21 相互作用的蛋白构建蛋白相互作用关系网。值得注意的是，MMS21 的互作蛋白与细胞周期调控密切相关，如Cyclin A2，MCM3/5/6等（图5D-5F）。

图5 MMS21互作蛋白组聚类分析Fig.5 Bioinformatic clustering analyses of MMS21 interactome

2.6 MMS21参与调控肝癌细胞的周期蛋白

细胞周期受到细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶等的共同调节。如图6A 所示，在经典细胞周期模型中，G1期细胞受生长因子刺激会导致D型细胞周期蛋白（Cyclin D1、D2 和D3）上调，进而激活细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4/6，形成的Cyclin D-CDK4/6 复合物与E 型细胞周期蛋白（Cyclin E1 和E2）及其相关激酶（主要是CDK2，但也有CDK1/3）磷酸化并使视网膜母细胞瘤蛋白Rb 失活。在协同作用驱动下细胞进入S 期，此时细胞周期蛋白A2（Cyclin A2）上调并与CDK1/2 结合促进S期进展。在第二个间隙阶段（G2）之后，细胞周期蛋白B（Cyclin B）易位到细胞核，激活CDK1，并推动遗传物质分离到子细胞。通过质谱结果，提示我们MMS21 可能参与调控细胞周期蛋白。为了验证这一假说，我们进行了蛋白质印迹分析，结果显示MMS21 敲低后，可以显著降低S 期和G2/M 期的周期蛋白表达量，而对G1 期的前期周期蛋白没有显著变化，G1 期的后期周期蛋白E1 水平增加（图6B）。微小染色体维持蛋白家族（minichromosome maintenance proteins，MCMs）是DNA 复制所必需的蛋白，MCM2-7形成的六聚体具有DNA解旋酶活性是DNA复制解旋酶的催化核心，在单个细胞的S期中确保基因组DNA 完全准确的复制。为了进一步证实MMS21 参与细胞周期的调控，我们敲低MMS21 蛋白后检测MCM2-7 复合物的蛋白水平，发现整个复合物蛋白水平都降低，其中MCM3/6 降低尤其明显。综上所述，MMS21 能够影响细胞周期蛋白表达水平进而调控肝癌细胞的增殖（图6C）。

图6 MMS21参与调控肝癌细胞的周期相关蛋白稳定性Fig.6 MMS21 maintained the protein stability of several cell cycle regulators in HCC

3 讨论

近年来，随着手术方案的改进以及新的化疗方案等的出现，虽然肝癌患者的生存率较前有所提高，但是肝癌患者的预后仍然较差［8］。因此，深入阐明肝癌发生发展的分子机制，对于寻找新的诊断及治疗靶点、改善肝癌患者的预后具有十分重要的作用。

在本课题研究中，我们通过GEPIA 和CPTAC数据库分析发现，在肝癌组织中MMS21 的mRNA和蛋白水平均呈高表达，并且其高表达与肝癌患者不良预后相关。进一步，通过qPCR 和Western blot检测LO2（人正常肝细胞）、Huh7、HepG2、SK-Hep1和SUN-182 等细胞系，发现在肝癌细胞系中MMS21 的mRNA 和蛋白水均显著上调。提示，MMS21 在肝癌中可能发挥促癌的功能。同时在GEPIA 数据库中，我们也发现MMS21 在胆管癌（CHOL）、弥漫大B 细胞淋巴瘤（DLBC）、胶质母细胞瘤（GBM）、胰腺癌（PAAD）和胸腺癌（THYM）中均呈高表达，提示MMS21 在多种肿瘤中扮演促癌基因的角色。对于MMS21 在多种肿瘤中高表达的原因，我们推测可能有以下三个方面的因素：1、在DNA 水平，通过UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）中的TCGA 数据库发现，相比于癌旁组织，在肝癌组织中MMS21 的启动子甲基化水平更低，提示MMS21 启动子的去甲基化与肝癌的发生发展密切相关；2、在转录水平，利用miRDB 数据库（http：//www.mirdb.org/）预测MMS21 可能相互作用的microRNA，发现其可作为miR-3143，miR-498-5p，miR-302c-5p，miR-6798-3p，and miR-31-3p 等microRNA 的靶基因。Jing 等［9］发现在宫颈癌细胞中miR-31-3p显著下调，体外过表达miR-31-3p能够抑制宫颈癌细胞的恶性行为和EMT，提示我们microRNA 可能参与调控MMS21 的mRNA 表达水平；不过我们也不排除还有其他潜在的转录因子，在转录水平介导MMS21 的表达，我们后续将进一步实验研究证明；3、在蛋白水平，通过分析Co-IP联合质谱鉴定MMS21 的互作蛋白，我们发现MMS21 与去泛素化酶（DUB）家族中的USP5/33/37/53 有相互作用，这提示我们去泛素化酶也参与MMS21 的蛋白稳定性调节，对此我们将在接下来研究中深入探讨。Jacome 等［10］在转基因鼠的研究发现，MMS21 的单拷贝缺失可以增加淋巴瘤等肿瘤的发生率，而且这种作用并不依赖于其SUMO 化酶活性。Potts 等［11］报道，在骨肉瘤细胞中，MMS21参与形成的SMC5/6复合体能够调节端粒结合蛋白的SUMO 化修饰，介导端粒的同源修复和延长抑制肿瘤细胞的衰老。然而，Ni 等［12］发现，在乳腺癌MCF-7 细胞中，MMS21 参与细胞DNA 损伤修复和细胞有丝分裂进程导致细胞增殖受阻。因此，MMS21 在不同的研究模型或肿瘤中，可能通过不同的机制发挥着截然不同的作用。然而MMS21 在肝癌中的功能及作用机制目前尚未见报道。在本研究中，我们通过流式细胞术、BrdU、DNA Fiber 等多种方法检测了MMS21 对肝癌细胞增殖等影响。结果表明，当MMS21 缺陷时能够明显抑制肝癌的细胞周期进程，阻碍细胞由G1 向S 期的转换，从而使其阻滞在G1 期。MMS21 已被证明有助于DSB修复、暂停复制叉重启和HR 的端粒伸长［13］。当复制叉遇到阻力会导致复制叉停顿，DNA Fiber 技术已成为直接监测DNA 复制叉动力学的金标准［14］。DNA Fiber 分析结果表明，敲低MMS21 能阻碍复制叉的前进，抑制DNA合成速度，这提示MMS21与肝癌细胞复制叉进程有关。MMS21作为SMC5/6复合体的一员，在调节DNA 损伤修复过程中具有重要作用，而DNA 损伤与细胞周期的有序进行密切相关［15］。为了更直接的阐明MMS21 调节细胞周期的作用，我们通过Co-IP 联合质谱鉴定的方法检测了MMS21 的互作蛋白组。结果发现，MMS21 的互作蛋白主要与细胞周期相关通路有关。这提示我们，除了通过调节DNA 损伤修复间接促进细胞周期的正常进行，MMS21 还可以通过结合细胞周期相关蛋白直接调节细胞周期。为了证实这一猜想，我们检测了MMS21对细胞周期相关蛋白的调节作用，发现MMS21能够调控细胞周期相关蛋白的表达，敲低MMS21 能下调S 和G2 期周期蛋白Cyclin A2 和Cyclin B1的蛋白水平同时上调G1后期蛋白Cyclin E1水平，提示MMS21的缺陷导致细胞阻滞在G1期，抑制G1/S的转变。MCMs蛋白家族在所有真核生物中具有高度保守性［16］。既往研究将MCM 确定为DNA复制起始的核心参与者［17］。最近的研究表明，MCM 蛋白也在复制延长中起作用，可能作为DNA解旋酶［16］。MCMs 在整个细胞周期中组成性地定位于细胞核中，它们与染色质结合，受细胞周期蛋白调控［18-19］，同时MCM 与扩展复制叉相关联，其动力学与DNA 合成因子相似，随着复制叉的扩展而移开［20-21］。我们在质谱蛋白互作数据中发现，MMS21 与MCM2/3/5/6 相互作用，同时敲低MMS21能下调MCM2-7 复合物内的几乎所有蛋白的稳定性。然而，MMS21 对其结合的细胞周期相关蛋白的调节是否依赖于其SUMO 化酶活性以及具体的调节靶蛋白是什么，以及MMS21 对于MCM2-7 复合物的稳定性调节具体机制，目前尚不清楚。我们将通过后续研究对此问题进行深入阐明。

综上所述，本研究证实MMS21 在肝癌中高表达，并促进肝癌细胞的生长，其机制为调控细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶表达，同时影响MCM2-7 复合物的蛋白水平。这些数据表明MMS21 可能是肝癌诊治的潜在新靶标，为肝癌的诊断和治疗提供新思路。