蝮蛇咬伤患者程序性死亡因子-1和T淋巴细胞亚群的表达与病情严重程度的相关性分析

姚洪锋 吕彩萍 郭瑜佳 陈文泱 骆方军 何玉领

我国每年蛇咬伤患者10～30万人次，有较高的致残率及致死性［1］。本地区地理环境适宜蛇类生长，尤以蝮蛇居多，每年发生蛇咬伤患者较多。蝮蛇咬伤后主要是蛇毒毒素或酶激活炎症细胞，释放炎症介质并引起过度炎症反应，引起机体损伤，炎症因子C反应蛋白（CRP）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）等明显升高［2］。过度的炎症反应引起机体生理、病理变化的同时，也影响机体的免疫平衡。目前关于蝮蛇咬伤患者免疫状态变化及相应机制的报道较少，但在类似的中毒反应时可见淋巴细胞功能异常［3］。程序性死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）作为免疫调控抑制因子，在感染、炎症、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病中发挥重要作用［4］。但在蝮蛇咬伤患者中PD-1的表达及与严重程度变化尚不清楚，本文探讨蝮蛇咬伤患者T淋巴细胞亚群、PD-1的表达变化及在评估病情严重程度与预后中的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2016年3月至2019年8月本院蝮蛇咬伤患者106例，根据《2018年中国蛇伤救治专家共识》［5］蛇咬伤严重度评分表分为轻度蝮蛇咬伤组75例与中、重度蝮蛇咬伤组31例；其中中、重度组中有23例患者经治疗康复后14 d随访复查。另选取同期本院体检中心健康体检者30例作为健康对照组。三组受试者性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。（1）纳入标准：①符合《2018年中国蛇伤救治专家共识》诊断标准，明确为蝮蛇咬伤，常规予以清创局封、季德胜蛇药及抗蝮蛇毒血清治疗；②在蛇咬伤后12 h内入院；③未在外院就诊，包括使用抗蛇毒血清等。（2）排除标准：①有自身免疫性疾病、细菌性感染、病毒性感染及其它可引起炎症的基础疾病；②合并有多器官功能障碍、昏迷、严重心、肝、肾、血液等系统疾病以及精神疾病。本项目经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法 （1）标本采集：蝮蛇咬伤患者于入院时直接采集2支2 mL EDTA抗凝血，其中1支立即3,500 r/min，离心10 min分离血浆并保存于-70℃冰箱内，用于CRP、SAA、IL-6、IL-10、TNF-α检测；另1支EDTA抗凝血立即完成T淋巴细胞亚群与PD-1分析。随访患者于随访当日空腹采集2支2 mL EDTA抗凝血。（2）血清CRP、淀粉样蛋白A（SAA）检测：均采用胶乳增强免疫比浊法检测，根据试剂说明书要求设置检测参数；仪器为日立7600全自动生化分析仪，试剂：SAA为浙江爱康生物科技有限公司；CRP为安徽伊普诺康生物技术股份有限公司。（2）IL-10、IL-6、TNF-α：采用流式荧光法检测，按试剂说明书要求检测，仪器为BD Canto II，使用Diva软件进行结果分析。试剂：江西诺德医疗器械有限公司的人Th1/Th2亚群检测试剂盒。（4）CD3+、CD4+、CD8+：采用流式细胞术检测，仪器：BD Canto II，试剂：BD 货号。将全血50μL和抗体试剂20μL加入到BD管中，混匀后室温静置孵育15 min，加入500μL溶血剂，震荡混匀后静置5 min，上机检测。使用BD Canto软件进行数据采集与分析。（5）PD-1检测：将获得的外周血单个核细胞悬液以1×106/μL分装于试管中，在单克隆抗体（20μL）和荧光素的共同作用下室温培养20 min。检测T淋巴细胞CD4+、CD8+细胞上CD279+表达量即为PD-1水平。所使用的CD3/CD4/CD8/CD279荧光单克隆抗体及其同型对照均购自美国BD Biosciences公司。加入500μL溶血剂，震荡混匀并静置5min，然后，细胞在1,500 r/min下离心5 min，用美国BD公司的 FACS CantoII流式细胞仪分析，BD FACS Diva 软件进行数据采集与分析。

1.3 统计学分析 采用 SPSS19.0统计软件。符合正态分布的计量资料用（±s）表示，两组比较采用t检验，相关性分析采用Pearson检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蝮蛇咬伤患者一般资料 见表1。

表1 蝮蛇咬伤患者一般资料

2.2 炎症因子、T淋巴细胞亚群及PD-1结果分析 见表2、图1。

表2 蝮蛇咬伤患者免疫功能分析（±s）

表2 蝮蛇咬伤患者免疫功能分析（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与轻度组比较，#P＜0.05

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2.3 各指标水平与蝮蛇咬伤患者SSS评分的相关性 CD4+/CD8+比值与蝮蛇咬伤严重程度呈负相关，CRP、SAA、IL-6、TNF-α、IL-10、CD4+PD-1+均 与蝮蛇咬伤严重程度呈正相关（P＜0.05），见表3。

表3 各指标水平与腹蛇咬伤SSS评分相关性分析

3 讨论

蝮蛇咬伤，主要表现为皮下出血、瘀斑，咬伤部位肿胀、疼痛，造成细胞破坏、组织坏死，肢体残废，严重者出现心功能不全、神经系统损伤、全身炎症反应综合征（SIRS）甚至多器官功能障碍综合征（MODS）［6］。其中IL-6、TNF-α等炎性细胞因子释放增加，且可用于临床严重程度及疗效评估［7］，这与本资料结果一致。SANTHOSH等［8］发现通过毒蛇毒液诱导的细胞实验中，IL-6、TNF-α水平均升高，同时，氧化应激及炎症反应明显增强；在藏红花预处理后的实验组中，可见IL-6、TNF-α水平降低，氧化应激及炎症反应减弱。

在正常生理条件下，CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例处于动态平衡，而在外界刺激下，CD4+/CD8+的平衡被打破，导致机体免疫内环境紊乱。本资料结果显示，蝮蛇咬伤患者CD4+T细胞百分数降低，CD8+T细胞百分数升高，且 CD4+/CD8+比值与病情严重程度呈负相关，这可能是蝮蛇蛇毒毒素引起T淋巴细胞免疫调节失衡，进一步引起机体的免疫状况和炎症的进展。周克兵等［9］发现蛇咬伤后的炎症变化与患者的免疫功能下降有关，当重症蝮蛇咬伤患者经乌司他丁治疗后随着症状的改善CD4+和CD8+T细胞表达水平逐渐升高，其中以CD4+T细胞尤为明显，同时细胞因子IL-6和TNF-α水平明显降低，这与本资料中观察到的变化情况一致，提示在蝮蛇咬伤时随着病情的好转，T淋巴细胞免疫平衡逐渐恢复，炎症减轻。类似的中毒引起淋巴细胞亚群变化的可见氯化氢气体、甲胺磷农药中毒患者，CD4+表达量与中毒严重程度、炎症反应程度正相关，致使机体免疫功能紊乱。

在免疫调节过程中，PD-1同样起重要作用。本资料显示，CD4+PD-1+在中重度蝮蛇咬伤患者中呈高表达，且与病情严重程度呈正相关；经治疗后CD4+PD-1+表达明显降低，同时炎症因子水平明显降低，CD4+T细胞表达明显升高，可能为PD-1通过调节免疫平衡，抑制炎症反应。PD-1其主要表达于T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞等，且在活化的T淋巴细胞表面、树突状细胞（DC）和单核细胞中表达上调，具有调节活化和效应期淋巴细胞的功能，在抗炎、抗肿瘤过程中发挥重要作用。HIRAHARA等［10］发现在系统性红斑狼疮中，疾病活动度高的患者有更高的PD-1水平，且随着治疗好转，PD-1水平逐渐降低，提示PD-1可作为SLE疾病活动度的标志物。在脓毒血症患者外周血记忆性CD4+T淋巴细胞中存在高表达的PD-1水平，说明在炎症过程中存在免疫抑制的现象［11］。韩辉等［12］发现Grave's病患者外周血CD4+、CD8+细胞中PD-1表达升高，促进甲状腺滤泡上皮细胞活性，导致炎性细胞因子水平升高，加速GD的发生和发展。在恶性胶质瘤中，PD-L1表达上调，促使CD4+、CD8+T细胞增加，并加重了炎症反应［13］。贾炜炜等［14］在肝包虫病合并HBV感染患者中证实了CD4+PD-1+的表达与肝功能损伤程度密切相关，说明PD-1对T细胞的调节具有重要意义。在SIV病毒感染的动物模型中，促炎细胞因子TNF-α，IL-6显著增加，PD-1在肺泡巨噬细胞（AM）上表达明显增加，并与血浆病毒载量有明显的相关性，表明PD-1表达通过调节AM的功能活性，参与疾病进展［15］。

综上所述，蝮蛇咬伤后机体存在T淋巴细胞调节失衡并伴有细胞因子分泌紊乱，且与病情严重程度相关。PD-1表达与病情严重程度相关，提示PD-1可能参与蝮蛇咬伤后机体免疫功能变化，这可为蝮蛇咬伤患者的进一步诊治提供了新的思路。