骨肉瘤生长侵袭相关调控蛋白的研究进展

夏安然，罗群强，甘林

1.右江民族医学院，广西百色 533000；2.右江民族医学院附属医院手足外科/小儿骨科，广西百色 533000

骨肉瘤是一种最常见的原发恶性骨肿瘤，一般在儿童以及青少年群体中发病率较高，临床工作中常见骨肉瘤集中在长骨干骺端，目前在临床上针对骨肉瘤的治疗手段多采用手术切除肿瘤，结合全身化疗以控制微转移瘤。根据最近几年的临床统计，原发性骨肉瘤患者的五年生存率约为70%，但进展的转移性或复发性疾病患者的总生存率低于20%。虽然随着各项研究开展，临床中对骨肉瘤的了解不断加深，而且在临床试验中多次通过改变化疗药物剂量或者尝试研发新型的化疗药来加强疗效。令人沮丧的是，由于骨肉瘤的特异性较大，目前对骨肉瘤患者的临床治愈能力依旧没有明显提升，导致骨肉瘤患者的预后并不理想。特别是一些在初诊时就已经确定发生肿瘤转移的患者，其五年生存率只有20%左右。近年来，采用针对性疗法改进治疗方案提升患者预后生存率的问题依旧存在，然而却面临着缺乏特定研究目标的困扰。根据目前的研究进展来看，针对性治疗骨肉瘤的靶向化疗药物或更加完善的临床治疗方案尚未成型。因此，寻找合适的生物标志物对骨肉瘤的早期监测及临床治疗具有重要的意义。本文通过对骨肉瘤生长侵袭中的相关调控蛋白的研究进展进行归纳综述，从而为骨肉瘤的针对性治疗、提高患者生存率找出新的治疗方案，进一步为临床治疗骨肉瘤提供科学依据。

1 Survivin 蛋白

生存素[1]（也称为Survivin、BIRC5）是一种进化保守的真核蛋白，在细胞分裂中的作用至关重要，可以抑制细胞死亡。通常，它仅在活跃的增殖细胞中表达，尤其在大多数癌症中表达上调。经研究发现，生存素在细胞内的抗凋亡作用与半胱天冬酶蛋白（caspase）直接和间接相关[2]。生存素基因是迄今为止发现最强的凋亡抑制基因，细胞凋亡是一种程序性死亡的主要形式，主要依赖于半胱天冬酶，在体内有两种凋亡途径：内在途径和外在途径，当接收到内源性应激信号时，线粒体释放细胞色素C，同时导致半胱天冬酶9（caspase-9）的激活从而调控细胞凋亡；相比之下，外源性途径则属于线粒体非依赖性，并且由配体与细胞表面受体的结合触发效应。两种途径都有半胱天冬酶3 和7（caspase-3、caspase-7）存在，其通过分离下游大分子导致细胞凋亡。近年来的研究重心已将生存素作为肿瘤治疗的潜在药物靶点。研究表明，caspase 在临床上的大多数癌症中都呈现高表达状态，且高度影响患者预后情况，而且通过caspase 在癌症细胞中的高表达同样可以用来判断其癌症细胞的增殖能力以及预测治疗效果，而caspase 在骨肉瘤的增殖分化以及生长侵袭中同时具有重要作用[3]。这种关联表示生存素在骨肉瘤的生长侵袭中同样也具有一定的相关性。夏鹏等[4]通过构建特异性siRNA，将siRNA 转录至骨肉瘤MG-63 细胞中。并检测在MG-63 细胞中FANCD2 基因的表达强度，实验结果证明，降低FANCD2 基因在细胞中的表达，则p53信号通路开始调控细胞凋亡。当FANCD2 基因表达受抑制时，细胞内TP53INP1 基因表达上调，该基因可促进p53 的磷酸化，导致p21 蛋白被激活，从而影响依赖caspase 介导的骨肉瘤MG-63 细胞，加速其发生凋亡[5]。这与王玉峰等[6]的实验结果相似。丁艳平等[5]则是通过选取45 例口腔癌石蜡标本，利用免疫组化方法将各个分组的口腔癌细胞的生存素以及caspase-3 进行染色，通过不同阳性染色程度进行区分总结，最后发现，随着口腔癌增生分化的严重程度增加，caspase-3 的阳性染色逐渐降低，生存素的表达逐渐升高。caspase-3 的表达被抑制，癌细胞增殖分化较前明显升高。而王玉峰等[6]在研究二硫代氨基甲酸吡咯烷（pynolidine dithiocarbamate, PDTC）抑制骨肉瘤MG-63 细胞的实验中，通过体外构建不同浓度的PDTC 培养骨肉瘤细胞，发现不同浓度的PDTC 对骨肉瘤细胞抑制效果完全不同，进行细胞实验验证后认为PDTC 通过促进半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（caspase-3）蛋白的表达，从而促进骨肉瘤细胞凋亡，抑制骨肉瘤细胞增殖分化。同时因为生存素对caspase-3 有直接抑制作用，二者表达程度成反比，从而认为生存素对于骨肉瘤癌细胞的生长侵袭以及后续的分化复发有明显促进作用。

2 TRIM35 蛋白

三方基序（tripartite motif, TRIM）家族是具有高度保守结构域的蛋白质家族。TRIM 家族蛋白的成员在癌症的发展和进展中起着至关重要的作用[7]。而在癌细胞生长侵袭过程中，蛋白质的翻译后修饰参与调节许多生物过程。其中泛素化是针对赖氨酸残基并调节许多细胞过程的翻译后修饰之一。目前研究表明，细胞实现泛素化反应需要3 种酶[8]：泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）。有研究指出，在癌细胞的泛素-蛋白酶体系统产生的生化反应中，泛素的结合反应由E1、E2 和E3 催化[9]。E3 是介导E2 和底物之间的支架，负责底物识别。而三元基序家族蛋白由于具有较高程度的E3 泛素连接酶活性[10]。所以在癌症、炎症性疾病和与生长相关疾病等多种疾病中均发挥调控作用[11]。TRIM 家族的其他成员与癌症发展有关，而不参与染色体的重新排列，目前看来可能就是通过泛素化或肿瘤抑制其蛋白功能丧失。而研究表明，TRIM35 在影响骨肉瘤生长侵袭过程中，可以通过介导上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的方式促进骨肉瘤细胞的生长侵袭以及增殖分化[12]。EMT 是一种细胞程序，在人体内对胚胎发生、伤口愈合和恶性进展至关重要。在EMT 被激活的情况下，癌症干细胞在人体中增长速度较前明显加快，直接加速了癌症的生长侵袭。目前Yu L 等[13]通过实验发现，EMT 与间质源性骨肉瘤相关。张杰等[7]通过免疫组化法发现TRIM35 在骨肉瘤组织中表达较正常组织显著提高。通过细胞划痕试验印证了过表达TRIM35 能够显著提高骨肉瘤细胞在组织中的迁移能力。而上述的研究结论均可以表明在骨肉瘤的生长侵袭以及预后转移的过程中，TRIM35 可以通过影响EMT 在组织中的表达能力，消除上皮细胞的极化，从而促进间质细胞的转移，进一步增加骨肉瘤癌细胞的生长侵袭能力。

3 Neurensin-2 蛋白

神经膜蛋白2（neurogenin 2, NRSN2）是一种小神经元膜蛋白，定位于神经细胞中的小囊泡中。有研究文献报道NRSN2 主要参与肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）以及非小细胞癌（non-smallcell lung cancer, NSCLC）的发生发展。Keremu A等[14]通过生物信息学分析方法在GEO 数据库找出NRAN2 蛋白，发现其在骨肉瘤组织中高度表达。经过研究证实，目前NRSN2 的表达在18 个新的骨肉瘤组织中更加常见。NRSN2 通过直接影响PI3K/AKT/mTOR 信号传导和间接影响Wnt/β-连环蛋白信号传导来促进骨肉瘤细胞在体内的生长侵袭。PI3K/Akt 是一条在多种癌细胞中发挥作用并高度活跃的信号传导通路[15]。大量证据表明，许多与癌细胞生长高度相关的转化因子通过PI3K/Akt 途径促进骨肉瘤组织的进一步恶化增殖[16-17]。PI3K/Akt在肿瘤的绝大多数恶性表型中都高度活跃，包括肿瘤生长侵袭、癌细胞增殖转移等[18]。根据文献报道，NRSN2 在组织中通过抑制或促进PI3K/Akt 信号传导通路以抑制或促进癌细胞凋亡或增殖[19]。Wnt信号传导通路在癌细胞生长侵袭过程中同样具有重要作用，研究表明，Wnt/β-连环蛋白信号传导在骨肉瘤细胞增殖中确实发挥着不可或缺的作用，其中，在Wnt 信号传导通路中最重要的就是β-连环蛋白（β-catenin）[20]。由于PI3K/Akt 信号传导通路可以抑制GSK3β 的活化[21]，从而影响到GSK3β 对β-连环蛋白的降解，导致β-连环蛋白降解速度变慢，从而抑制骨肉瘤细胞的凋亡。最新研究进展发现，由人骨髓间充质干细胞中所产生出的miR-1913 的外泌体转移也可以通过靶向NRSN2 抑制骨肉瘤的增殖生长[22]。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）在肿瘤微环境中的许多关键性的调节作用均依赖于各种机制，包括分泌细胞外囊泡。外泌体就属于BMSCs 所分泌的细胞外囊泡之一。外泌体通过传递各种核酸来参与细胞增殖生长以及转移分化[23]。Yu L 等[13]通过IHC 染色以及蛋白质印记等方法发现，相较于正常组织，NRSN2 在骨肉瘤组织中的表达上调。并通过实验研究表明，NRSN2 在骨肉瘤中的表达高度与骨肉瘤的增殖生长以及预后不良成正相关。

4 LATS2 蛋白

LATS 家 族蛋 白，包 括LATS1 和LATS2，LATS（大型肿瘤抑制因子）家族的肿瘤抑制因子（LATS1和LATS2）在维持细胞稳态过程中作用显著[24]。LATS 功能繁多，包括调节细胞增殖、细胞死亡和细胞迁移，通常在各种细胞中均参与调控，如转录调控和维持遗传稳定性。LATS 的活性通过各种机制受到严格控制，包括翻译后修饰，差异定位和表达。LATS1 或LATS2 的功能失调常会使细胞恶性增生，逐渐向肿瘤转化。它们的高度同源性和功能重叠，在Hippo-LATS 信号通路中早已得到印证，虽然对这些活动的具体潜在机制知之甚少，但目前的数据表明，LATS 信号传导与成熟的肿瘤抑制或致癌途径 相 交，包 括p53，Ras 或Akt 网 络。人LATS1 和LATS2 是AGC 亚家族的Ser/Thr 激酶，与核Dbf2 相关激酶（NDR1/2）关系最密切[25]。而Hippo-LATS 通路[26]中的激活因子Yes 相关蛋白[27]（YAP）和转录共激活因子PDZ 结合基序[28]（TAZ）的表达异常在大多数软组织肿瘤中影响颇深，YAP 不仅参与细胞增殖分化，同样也是重要的预后标志物[29]，而TAZ 对肿瘤干细胞自我更新及肿瘤形成能力起重要作用[30]，当然也可影响上皮-间充质转化[31]，临床上与肿瘤的复发关系密切[32]。LATS 激酶对于生物体健康，基因组完整性和癌症预防至关重要。对于LATS2蛋白而言，p53 可以直接与LATS2 启动子相互作用以诱导LATS2 表达。之前文献报道，LATS2 和YAP/TAZ 之间的这种负反馈回路有助于抑制YAP 活动的持续时间[33-34]，维持体内平衡并使Hippo 通路更加稳定，以抵抗YAP 过度表达所产生的致癌作用[35]。实验证明，当LATS2 缺失，加速了YAP 诱导的肿瘤细胞发生发展[36]。这表明保留LATS2 蛋白的高表达实际上有时可能对肿瘤有益[37]。作为LATS 家族蛋白，LATS1 与LATS2 对细胞的作用不同[38]，实验表明，癌细胞中与LATS1 相关的蛋白质与雌激素信号传导有关[39]，而LATS2 已经进化出与细胞周期、代谢和p53 相关的发散相互作用组[40]。p53 过表达将会导致骨肉瘤在内的大多数癌细胞凋亡。而在体内LATS2 和YAP/TAZ 之间的相互作用又可以减少YAP 的活动时间[41-42]，通过巩固Hippo通路达到抑癌效果[43]。最新研究表明，骨肉瘤癌细胞中的Hippo/YAP 和Wnt/β-连环蛋白两种信号通路不仅对生理成骨发挥重要作用，而且对骨肉瘤的生长侵袭至关重要[44-45]。这两条信号通路之间关系紧密，尤其，β-catenin 可以弥补YAP-敲除MSCs中的成骨缺陷[46]。激酶LATS2 严格控制YAP 的活性[47]：通过在Ser127 磷酸化YAP，LATS2 促进了细胞核的退化[48]，随后YAP 的细胞质降解。因此，LATS2 能有效拮抗YAP/β-连环蛋白信号传导[49-50]。Hippo 通路在骨肉瘤的肺转移中也占有很重要的地位[51]。所以这也表明LATS2 蛋白对骨肉瘤癌细胞的发生发展以及预后治疗都具有较明显的抑制作用。为骨肉瘤的预后治疗提供了潜在的策略以及研究方向[52]。

5 总结与展望

目前与骨肉瘤生长侵袭有关的相关蛋白正在越来越全面地被发现，上述四种蛋白只是在近年实验研究中相较于其他蛋白而言，对骨肉瘤生长侵袭影响更深。骨肉瘤作为一种治愈难度高、预后较差的恶性肿瘤，其在人体内的发生发展具有相当复杂的发病机制。当然还有许多尚未被研究发现所阐明的蛋白在人体内发挥着重要作用。在骨肉瘤的蛋白作用机制中，单一蛋白或是多重蛋白相互结合对骨肉瘤的生长侵袭更具主导作用，还需要进一步地进行实验论证。但令人坚信的是，以此为切入点进行更加深入全面的研究对临床靶向治疗骨肉瘤提供了更好的新思路。

由于骨肉瘤的恶性程度较高，其在临床上的治愈率较低，骨肉瘤细胞的高度活跃能力以及基因高表达使骨肉瘤在早期就对机体造成严重的破坏，并且随着转移复发情况的出现，更进一步地降低了骨肉瘤患者的生存率以及预后。随着临床化疗耐药性的逐渐增加，单纯靶向治疗骨肉瘤的新方法尤其被需要，这就需要更加全面深入地研究骨肉瘤生长侵袭的特性以及蛋白标志物，追根究底，研究出新型的低耐药的靶向治疗药物，更好地抑制骨肉瘤癌细胞在体内的增殖分化，从而更好地提升患者预后以及生存率，从根本上解除患者病痛。目前国内外对于骨肉瘤的研究正在逐渐地从简单的发生机制研究向细胞内基因表达信号通路以及蛋白标志物上进行转变，对于骨肉瘤的生长侵袭研究已经日趋完善，接下来，通过研究其特异性蛋白标志物和能够影响其发生发展的主要信号通路并进行实验验证，从而找出更好更新颖的治疗骨肉瘤的方法是当前要开展的工作。通过抑制其主要的相关信号通路以及促进特异性蛋白标志物失活来达到抑制骨肉瘤生长侵袭的作用，为研究出骨肉瘤的单纯靶向治疗药物进一步提供更好的理论支撑，为临床上提供更完善的治疗计划，从而开发出更具有特异性的抗癌药物。