甜菜原生质体制备研究进展

李心如,张福顺,2,邳 植,3

(1.黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080； 2.农业农村部甜菜品质监督检验测试中心，哈尔滨 150080；3.黑龙江省普通高校甜菜遗传育种重点实验室，哈尔滨 150080)

0 引 言

甜菜(Beta vulgaris L.)具有耐寒、耐干旱、耐盐碱等特点，具有抗逆性强、适应性广的特性。甜菜是甘蔗以外的一个主要糖来源，属于我国主要的糖料作物。除此之外，甜菜还可以生产出具有较高综合利用价值副产物。通过对甜菜的特殊处理可以生产甲醇、乙醇、甘油等，也是制作金霉素等许多医药与轻工业产品的原料，也可以生产肥料、饲料等[1]。甜菜属于两年生作物，传统的育种自交系的方法具有耗时长、成本高、易受环境气候影响的弱点。可以采用生物技术手段来培育自交系，如花药培养和花粉培养、未授粉胚株培养、原生质体培养与融合、离体筛选和诱变育种。其中原生质体培养和细胞融合是细胞工程的重要内容。原生质体是除去细胞壁的植物细胞和细菌细胞，仍有正常细胞的全部功能。原生质体可以用来研究无性杂交、亚细胞定位、目的基因的瞬时表达、遗传转化和突变体的选择。植物的原生质体可以为植物遗传改良、研究生理过程现象提供理想材料。由于原生质体没有细胞壁的阻隔，可以通过原生质体的融合进行的体细胞杂交，可以克服杂交不亲和的问题，为杂交育种提供了新的手段。

原生质体的首次提取是Klercker[2]在1892年通过机械法在水剑叶叶片中获取的。原生质体的制备研究真正开始于1960年，由Cocking[3]通过酶解法在番茄的根尖中获取的大量的高质量原生质体。1972年Rona[4]利用酶解法建立了欧亚槭的原生质体再生体系，进而为木本植物的原生质体的培养提供了开端。目前在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、 烟草(Nicotiana tabacum L.)、水稻(Oryza sativa L.) 、棉花(Gossypium spp.) 、小麦(Triticum aestivum L.) 等植物中，已经建立了非常高效的原生质体瞬时转化体系，并应用于各项基础研究中。

甜菜原生质体成功提取在1976年，由Li成功分离出甜菜原生质体；1981年，前苏联学者MmolenSkays分离培养出来甜菜原生质体并获得了细胞团；1985年，Szobados 和Bhat 获得了甜菜原生质体产生的愈伤组织；国内首次获得甜菜原生质体愈伤组织在1986年，由中国农业科学院甜菜研究所邵明文等人获取；在1988年和1990年荷兰学者Krens 及其同事两次报道了成功离体培养了甜菜原生质体，并由此培育出再生植株；此后，1992年李永峰等[5]、1993年的郭九峰[6]及马有会等[7]相继报道了由甜菜原生质体培养获得愈伤组织以及体细胞胚，但是没有得到再生植株；在1994年郭九峰等[8]初步报道了从甜菜未授粉胚珠或胚的愈伤组织中获得了原生质体，并得到再生植株，但是没有重现性。目前，甜菜原生质体的大规模分离还不够成功，存在原生质体分离困难、活力较低、完整性较差等问题。本文根据原生质体的制备体系流程，讲述影响原生质体提取的因素，并介绍其研究进展，为了进一步完善甜菜原生质体制备体系，对甜菜原生质体的应用进行研究。

1 原生质体的分离

1.1 制备材料的选择

选择制备材料时需要考虑到材料的品种、组织类型以及生理状态等因素的影响。原生质体分离的原始材料可以从植物的叶片、根、茎、果实、花等器官中分离获取，也可以从愈伤组织、胚性愈伤组织、肿瘤组织、悬浮细胞、雌雄配子体等中分离制备。通过大量研究发现，采用悬浮细胞分离原生质体，在实验过程中存在操作难的问题，并且悬浮细胞处于未分化的阶段，由此得到的原生质体不适合进行下一步的研究。在进行实验时，要十分注意保持材料的培养条件的相对稳定性。

目前以报道的甜菜原生质体制备主要以愈伤组织、子叶、悬浮细胞、保卫细胞等材料，并且通常选择生长数周的幼嫩子叶的切段作为实验材料。如1993年马友会等[7]初次报道成功分离甜菜原生质体采用是甜菜子叶的切段。

1.2 材料的预处理

很多研究表明，酶解过程对于原生质体来说是有害的。在进行实验前对材料进行预处理，可以改变细胞核、细胞壁的生理状态，避免损伤细胞膜，既可以提高酶解效率，同时又能减少破坏原生质体，提高原生质体的产量，增强原生质体的活力以及保持原生质体的完整性[9]。对材料的预处理可以采用暗处理、冷处理、物理破坏组织、真空渗透处理、预先质壁分离处理等方式。郭九峰等[6]在酶解前将愈伤组织经过一定时间的低温处理。马有会等[7]在酶解前将子叶置于黑暗、4℃的条件下24 h，并且将子叶切条后放入CPW11M高渗溶液中先预质壁分离6h。刘巧红等[10]在酶解前先将子叶切条，然后放入CPW12M高渗溶液进行4 h的预质壁分离。除此之外，在实验中通常会将子叶切成1mm宽的小条，在进行酶解，这样增加了实验材料与酶溶液的接触面积，可以提高酶解的效率。

1.3 原生质体分离方法

分离植物原生质体的方法主要是机械分离法和酶解分离法，目前在使用中酶解分离法更为常用。

1.3.1 机械分离法

机械分离法是将植物细胞放在高渗糖溶液中使材料发生质壁分离，待原生质体收缩成球后，与细胞壁进行脱离，之后使用剪刀等器具破坏细胞壁，将完整的原生质体从伤口释放出来。机械法可以避免酶制剂对原生质体的破坏作用，有利于开展生理生化研究。一般只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功，如洋葱球茎鳞片、萝卜根、甜菜根组织等。但是机械法具有操作困难、产量不高、活性较低的缺点，只是在用酶解法酶解细胞壁时有很多副作用时，可采用此法。同时分生组织和液泡化程度不高的细胞不适合使用机械法。因此，现在很少人使用机械法对植物细胞进行分离。

1.3.2 酶解分离法

现在对于分离原生质体最常用的方法是酶解分离法。酶解法是指将材料放入能够降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。酶解法首次使用是Cocking[3]在1960年利用纤维素酶粗制剂从番茄的根尖中分离出大量的高质量原生质体。酶解法分为振荡酶解和静置酶解。振荡酶解是将材料放在振荡器或者摇床进行酶解；静置酶解是在合适的温度下，将酶液处于静止状态对细胞进行酶解。采用的酶主要有纤维素酶、离析酶、果胶酶、半纤维素酶和崩溃酶等。植物细胞的细胞壁主要成分为纤维素和果胶，因此在分离植物原生质体时，纤维素酶和果胶酶最为必要。纤维素酶主要起到去除植物细胞壁的纤维素的作用；果胶酶可以加快细胞间隙的果胶质的分解，促使细胞相互分离；离析酶可以消化细胞骨架的果胶质成分，可以分离粘连在一起的植物细胞。其中果胶酶对于植物原生质体的伤害较大，因此可以选择属于果胶酶类的离析酶来代替果胶酶进行试验。马有会等[7]在对甜菜双丰10号子叶分离原生质体时采用的是2%的纤维素酶R-10、1%的离析酶R-10和0.5%的崩溃酶。由于不同研究中使用的酶的种类和浓度不同，实验中酶制剂的选择要根据材料的不同而定。

酶解法中，除了酶液的组成、浓度以外，酶液的pH值、酶解时的温度和时间、酶解渗透压以及转速都会影响着原生质体的产量和活力。其中酶液的pH值影响着酶的活性和质膜的稳定性，过高或者过低的pH值会改变细胞结构，破坏原生质体的形态。酶解液pH值一般和植物最适生长pH值相符，一般在5.4～5.8之间，甜菜原生质体分离实验中pH值一般为5.7或5.8。同时在酶液中可以添加适量的MES，可以维持酶解期间的pH值稳定性。酶解时的温度对原生质体的分离产生多样的影响，温度升高会加快酶解反应的速度，但温度过高会导致酶失去活性。因此，在酶解时要注意选择适宜的温度。酶解温度一般控制在25～30℃的范围内，甜菜原生质体分离实验中酶解时温度一般控制在25～27℃范围内。酶解时间在不同植物种类、材料中是不同的，一般在4～24 h之间，酶解的时间过长会影响原生质体的活性，酶解时间过短会导致分离出的原生质体数量太少。甜菜叶片的酶解时间一般在10～14 h之间。

在酶解液中一般会添加入一定浓度的质膜稳定剂和渗透压稳定剂，可以有效防止游离出来的原生质体发生破裂。经常用的渗透稳定剂主要分为盐溶液(如KCl、KH2PO4)和糖溶液(如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖)[11]。其中最常用的渗透压调节剂是甘露醇，甘露醇为代谢惰性，不被植物细胞吸收利用[12]，浓度一般在0.4～0.6 mol/L，可以保持原生质体较高的活性。在酶解过程中可以通过摇床加速原生质体的分离，转速通常控制在30～50 rad/min，可以有效防止原生质体机械损伤。此外，在进行酶解时，光照可能会损伤细胞质膜，导致原生质体活力下降，因此在原生质体酶解实验时一般选择黑暗或者弱光的环境。

2 原生质体的纯化与活力检测

2.1 原生质体的纯化

经过酶解的处理之后，还需要进一步的对原生质体提纯，以此来获得高活力的高纯度的原生质体。纯化原生质体是很有必要的，因为酶解后得到的是含有原生质体、未分解的细胞、细胞碎片、原生质体碎片等复杂成分的溶液，里面的杂质会污染后续的实验。原生质体纯化的方法主要有离心沉降法、漂浮法和界面离心法[13]。最常用到的是离心沉降法，原理是因原生质体性质较大，通过离心可将原生质体沉于底部，便于进一步的收集，这种方法操作方便，损失也少，但是纯度不高[14]；通过漂浮法纯化的原生质体纯度高，但是收率较低[15]；通过界面离心法得到的原生质体大小均匀，但是收率比较低[16]。马有会等[7]在对甜菜原生质体的提纯中采用了离心沉降法，将滤液放入500 rpm速率下的离心机进行3～5 min的离心，然后去除上层的杂质，采集底部的原生质体。

2.2 原生质体活力的检测

检测原生质体活性常用的方法有荧光素二乙酸(FDA)染色法，酚藏花红染色法、台盼兰染色法、荧光增白剂染色法等[17]。荧光素二乙酸(FDA)染色法是检测原生质体活性最常用的方法，FDA本身是没有荧光的，是可以穿过细胞膜自由出入细胞的，在活细胞中FDA 经酯酶可以分解为荧光素，在镜检时显示黄/绿色荧光，死细胞显示红色荧光或者是不发荧光的[18]。刘巧红等[10]采用2.0%Evans blue 染色测定原生质体活力。

3 当前存在的问题

近年来，关于植物原生质体研究得到了快速的发展，有更多的植物种类通过原生质体得到了再生植株，有一些的植物建立了比较完善原生质体制备体系。但是甜菜原生质体分离的报道较少，还处在不断探索的阶段。在甜菜原生质体分离中还存在着原生质体分离困难、原生质体活力不高、效率低等问题。

对于分离材料而言，在现有对于原生质体分离的研究中，每次研究往往只选取一个品种来探索原生质体分离条件，且材料单一，导致具有一定的局限性。在目前对于甜菜原生质体分离材料中主要是选择愈伤组织或者子叶。一些报道选择甜菜子叶为分离材料时，原生质体分离的难度较小，但是叶片表面蜡质层相对较厚，导致分离出的原生质体较少。选择胚性悬浮细胞或愈伤组织作为甜菜原生质体分离实验材料时，原生质体的产量较高、活力较强，分离出的原生质体也有易培养、易分化的优点，但是培养悬浮细胞系周期较长。

对于酶解条件而言，已有的报道中主要采用的纤维素酶、离析酶和果胶酶对甜菜原生质体进行分离实验，但是不同报道中酶解液的成分和比例是不同的，所用的材料也是不同的。因此，得到的最适组合是不同的，需要综合考虑酶液的pH值、酶解时的温度和时间、酶解渗透压以及转速等多种因素的影响。在对于酶解时间的选择上，马有会等[7]认为酶解10 h得到的效果更好，而刘巧红等[10]认为酶解12 h得到的效果更好，说明不同的实验条件下，实验条件的优化要具有针对性。

对于原生质体应用而言，现有的甜菜原生质体制备中，实验要经过一系列的操作才能分离出原生质体，在实验中原生质体容易受到化学损伤和机械损伤，降低原生质体活力，加大了原生质体培养的难度，致使成活率低，阻碍了原生质体的应用。因此，需要建立一种简便高效的甜菜原生质体制备体系，便于研究无性杂交、亚细胞定位、目的基因的瞬时表达、遗传转化和突变体的选择等。

4 研究展望

甜菜原生质体高效分离体系尚未完善，近年来，对于甜菜原生质体制备的研究较少。甜菜原生质体研究应用的基础是可以轻易得到大量活力高的原生质体。根据已有研究表明，原生质体制备的第一步是选择合适的分离材料。再者是酶解时选择合适的酶液种类、浓度、酶液的pH值、酶解时的温度和时间、酶解渗透压以及转速，以此获得的原生质体产量更大、活力更高。影响原生质体分离效率的因素很多，可以通过正交实验对不同品种不同类型的材料进行实验，从而明确单个因素对结果的影响水平，进而优化实验参数，确定甜菜原生质体制备所需的最佳条件，构建甜菜原生质体分离体系。邹彰毅等[19]通过单因素试验和正交实验研究发现菌龄、溶壁酶浓度、酶解时间、酶解温度、pH5个因素对姬松茸原生质体制备及再生的影响，进而建立了姬松茸原生质体分离体系，以提高姬松茸原生质体产量和再生率；杨成兰等[20]以青稞幼叶为材料设计4因素3水平的正交实验，包括甘露醇浓度、酶解时间、离心速度和不同苗龄因素，对青稞原生质体制备进行优化。

甜菜原生质体制备还存在一定的困难，甜菜原生质体的成功制备可以更好的研究甜菜在体细胞杂交、亚细胞定位、无性杂交、基因转化和诱导突变体等，可以进一步的加快有关甜菜遗传学、生理生化等实验技术的发展，对于甜菜的遗传育种具有重要意义。