NSCLC患者基因突变与其临床病理特征的相关性*

董跃华 王贵刚 杨燕君 魏玉磊 高永山 姜伟华

(河北北方学院附属第一医院胸心外科，河北 张家口 075000)

在我国恶性肿瘤发病及致死率中，肺癌居首位[1]。非小细胞肺癌(Non-small-cell lung carcinoma，NSCLC )则是肺癌中主要类型。虽手术、放化疗等治疗方式已应用多年，但整体疗效不尽理想，且多数患者在初诊之时已错过治疗最佳时机[2-5]。随着人们对癌基因依赖研究不断深入，EGFR基因靶向疗法以其良好的药物响应率及低副作用等特点逐渐成为NSCLC主要治疗手段之一[6]。因此，对致癌基因的研究，尤其对致癌基因与病理分型及预后关系的探讨，有助于在治疗过程中筛选优势人群[7-9]。Runx3是TGF-β信号通路中重要的调节因子之一，其表达缺失将限制Smad蛋白功能，干扰TGF-β信号通路的生物活性，导致肿瘤发生[10]。间质上皮转化因子(Met)及下游信号通路的异常激活介导肺癌等多种肿瘤的演进，且Met基因扩增与EGFR敏感性突变患者耐药性产生密切相关[11]。研究[12]显示，TGF-β与HGF/c-Met信号通路在癌症发展过程中存在负相关性。基于EGFR、Runx3、Met三者在NSCLC发病过程中的作用及联系，本研究探讨NSCLC患者EGFR、Runx3和Met突变情况与其病理分型、TNM分期及生存期的相关性，旨在为NSCLC的个体化靶向治疗提供更多临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年2月～2016年8月我院经手术途径留取新鲜肿瘤标本96例。入选标准：①经术后病理确诊为NSCLC。②亚裔患者。③未接受过分子靶向药物、放疗及化疗药物治疗。④既往无身体其他部位恶性肿瘤病史。其中男性63例，女性33例；60岁以下41例，60岁及以上55例；吸烟32例，不吸烟64例。按照国际抗癌联盟(UICC)(2016)分期标准[13]，Ⅰ期23例，Ⅱ期22例，Ⅲ期29例，Ⅳ期22 例。以2012年WHO制定的肺、胸膜、胸腺和心脏肿瘤病理学和遗传学中对肺癌的组织学分型标准[14]，其中腺鳞癌3例，腺癌26例，鳞癌67例。本研究所有程序均经医院的医学伦理委员审核批准(BFFY20140027)。本研究入选患者对研究过程知情，且自愿签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 仪器：LightCycler®96全自动荧光定量PCR系统(Roche公司，96 通量)，切片机(德国莱卡公司，2135)，台式高速度冷冻离心机(德国ELRCRON公司)，37℃恒温培养箱(上海天呈科技有限公司)。试剂：免疫组化S-P试剂盒、胃蛋白酶、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，鼠抗人EGFR单克隆抗体、兔抗人Runx3单克隆抗体、鼠抗人Met单克隆抗体(上海基尔顿生物科技有限公司)，Trizol试剂(invitrogen公司)，多聚赖氨酸(Sigma公司)。

1.3 DNA 提取及基因突变检测 将经10%中性福尔马林固定的样本进行常规HE染色，筛选出>50%肿瘤成分的瘤组织蜡块切片。肿瘤组织切片后置于离心管保存，一抗孵育前经柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L)进行抗原修复，采用免疫组化法测定EGFR、Runx3和Met表达。同时，对制备好的组织切片进行DNA提取，采用Nanodrop one测定DNA浓度，并以A260/A280值在1.8～2.0为有效值判断纯度。采用人多基因突变检测通用试剂盒进行扩增，应用二代测序仪进行高通量测序。所有检测依据试剂说明书及实验室规范进行操作。

1.4 随访 以电话或门诊形式进行随访，随访时间从病例确诊至2019年12月31日。随访期间记录患者后续治疗、肿瘤转移和复发等资料，并对患者的无进展生存时间进行统计。

2 结果

2.1 EGFR、Runx3和Met表达与临床病理特征关系 EGFR表达与患者年龄、性别、吸烟史、分期、组织学分型、复发转移、生存时间、病理分化均无关(P>0.05)；Runx3表达与分期、复发转移有关(P<0.05)，与年龄、性别、吸烟史、组织学分型、生存时间、病理分化均无关(P>0.05)；Met表达与分期、组织学分型有关(P<0.05)，与患者年龄、性别、吸烟史、复发转移、生存时间、病理分化均无关(P>0.05)，见表1。

表1 EGFR、Runx3和Met表达与临床病理特征关系Table 1 Relationship between the expressions of EGFR，Runx3，Met and clinicopathological features of disease

2.2 EGFR、Runx3和Met突变情况与临床病理特征的相关性 EGFR突变与患者组织学分型、生存时间有关(P<0.05)，与分期、复发转移、病理分化无关(P>0.05)；Runx3突变与患者组织学分型、分期、复发转移、生存时间有关(P<0.05)，与病理分化无关(P>0.05)；Met突变情况与患者组织学分型、分期、复发转移、生存时间、病理分化均无关(P>0.05)。见表2。

表2 EGFR、Runx3和Met突变情况与临床病理特征的相关性Table 2 Relationship between the mutations of EGFR，Runx3，Met and clinicopathological features of disease

2.3 EGFR、Runx3和Met表达和突变情况与患者生存时间的相关性 EGFR突变与Runx3突变与患者生存时间呈正相关(P<0.05)；Runx3的表达及突变与患者复发转移呈正相关(P<0.05)，见表3。

表3 EGFR、Runx3和Met表达和突变情况与患者生存时间的相关性Table 3 Correlation between EGFR，Runx3 and Met expression and mutation status and patient survival time

3 讨论

近年来，我国肺癌发病率、致死率逐年攀升[15]。自1991年起，我国的肺癌死亡率跃居各类癌症之首，NSCLC占肺癌病理类型的80.85%。尽管NSCLC治疗方法取得了不少进展，但NSCLC总的5年生存率仍低于15%[16]。高特异性、高疗效、低毒性的分子靶向药物能够对肿瘤细胞特定靶点起效，成为肿瘤精准医疗的一大利器。以EGFR为分子靶标开发的EGFR酪氨酸激酶抑制剂是目前NSCLC治疗中应用最广泛、最典型的分子靶标药物[17]。因此，深入研究致癌基因与病理分型及预后关系，对在NSCLC治疗过程中筛选优势人群颇有益处。

鉴于EGFR在NSCLC发生、发展中的作用，本研究探讨了EGFR表达、突变与NSCLC病理分化、TNM分期、生存期等临床病理特征的关系。结果显示，EGFR表达在不同病理分化、TNM分期、生存期等临床病理特征间无差异，但EGFR突变与组织学分型有关(P<0.05)，该结果与汪园园等[18]的研究一致。有学者[19]认为EGFR酪氨酸激酶编码区基因突变是EGFR分子靶向药物奏效的必要条件之一，推测亚裔女性、无吸烟史、腺癌患对EGFR酪氨酸激酶抑制剂可能有较高的药物敏感反应，该推测在Seow等[20]研究中得以证实。

Runx3为重要的新进抑癌基因，以往研究[21]显示，Runx3表达程度与肺癌患者生存率呈正相关，且Runx3低表达的患者肺癌复发转移率高、癌细胞多为低分化。本研究结果显示，Runx3表达与分期、复发转移有关(P<0.05)，提示Runx3的表达在NSCLC的发生、发展中可能起重要作用。此外，本研究结果表明，Runx3突变与患者组织学分型、分期、复发转移、生存时间有关(P<0.05)，60岁以下、腺癌患者Runx3突变率较高，与以往报道[22]相符。Tang等[23]研究则指出NSCLC的Ⅲ期患者比Ⅰ、Ⅱ期患者更容易发生Runx3突变，与本研究结果相一致。同时，本文结果表明，Runx3突变率在出现复发转移、生存期低于三年患者中更高，证实了Runx3突变是预后不良的重要原因。

Met基因扩增是EGFR酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药产生机制之一，此外，Met所介导的HGF/c-Met信号通路与Runx3参与的TGF-β通路在肿瘤发展过程中存在负相关性[24]。因此，Met基因在NSCLC发生发展及预后中更为关键。本研究发现，Met表达与分期、组织学分型有关(P<0.05)。Li等[25]研究表明，Met基因mRNA表达水平在腺癌患者中更高，且阳性率与患者TNM分期有关，与本研究研究结果相一致。目前对于Met基因突变与临床病理特征之间是否拥有联系尚无定论。本研究中Met基因突变率为2.6%～6.5%，与以往研究在NSCLC中的总发生率为3%～6%相符[26]。本文结果显示，Met突变与病理分型、生存期等无关，可能由于Met总突变发生率较低，本文病例较少所致。因此，有关Met基因突变与临床病理特征的影响有待后续进一步研究。

4 结论

NSCLC患者中EGFR突变可与Runx3、Met 突变共存，Met 突变率较低。EGFR突变与患者组织学分型、生存时间有关；Runx3突变与患者组织学分型、分期、复发转移、生存时间有关。因此EGFR与Runx3的突变有望成为NSCLC患者组织学分型、判断预后的潜在指标，为实施精准治疗提供理论支撑。