基于表面自聚合的多功能纳米探针制备及性能研究

汤 雯，边 静

(四川省科学城医院，四川 成都 610000)

光热治疗是目前治疗肿瘤最有效的一种医学手段，通过光热探针产生局部高温，杀死病灶处肿瘤细胞。在光热治疗中引入成像技术可以有效提高治疗的精准性。但传统常用纳米探针无法实现核磁共振成型，因此多模式成像功能的纳米光热探针的合成是目前研究的重点。对此，我国很多学者也作出了一些研究，针对TME响应的19F-MR纳米分子成像探针进行深入研究，证实19F-MR纳米探针在特定条件下，可在分子水平早期可视化TME中的恶性生物学行为，为实现肿瘤早期诊断及精准治疗提供有利支持；用线粒体作为线粒体靶向AIE探针区分癌细胞与正常细胞的靶标，使得聚集诱导发光探针能对癌症细胞进行准确诊断；通过水热法合成荧光生物质碳点BCDs，并将其应用到细胞成像中；但在纳米探针成像方面还存在不足。基于此，本文用表面自聚合方法合成钆离子修饰的硫化铋@聚多巴胺(BiS@PDA-Gd)复合纳米探针。设计试验证实BiS@PDA-Gd纳米探针能够为肿瘤诊断及治疗都提供了更精准的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

本试验主要材料：聚乙烯吡咯烷酮(PVP，山东豪顺化工有限公司，AR)、硫代乙酰胺(TAA，山东豪顺化工有限公司，AR)、甘露醇(AR，山东富禾生物科技有限公司)、硫代乙酰胺(AR，山东豪顺化工有限公司)、三(羟甲基)氨基甲烷(BR，济南汇锦川化工有限公司)、六水合氯化铁(AR，山东力昂新材料科技有限公司)、盐酸多巴胺(98%，西安泽朗生物科技有限公司)、六水合氯化钆(99.9%，山东力昂新材料科技有限公司)、超纯水(18 MΩ/cm，上海景纯水处理技术有限公司)。

本试验主要设备：精密电子天平(H0503，河北德科机械科技有限公司)、高速离心机(TG16KR，上海继谱电子科技有限公司)、紫外/可见光分光光度计(U-T6，屹谱仪器制造(上海)有限公司)、激光粒度仪(LS-POP(9)，珠海市欧美克仪器有限公司)、光学成像仪(Nexus 128，广州云星科学仪器有限公司)、临床前紧凑型磁共振成像仪(uMR 560，上海联影医疗科技有限公司)。

1.2 试验方法

..BiS纳米颗粒的合成

(1)在25 mL纯水中溶入1 g PVP，搅拌均匀后加入甘露醇0.227 5 g和Bi(NO)·5HO，充分搅拌使其完全溶解；

(2)用H0503型精密电子天平精准称取TAA 0.028 g，放入10 mL超纯水中，充分搅拌溶液；

(3)将以上步骤溶液混合，缓慢提升反应温度使其充分反应，反应温度和时间分别为100 ℃和1 h；

(4)取出反应产物，然后置于TG16KR型高速离心机中洗涤3次，离心转速和每次清洗时间分别为10 000 r/min和10 min。然后将洗涤后产物放入体积一定的超纯水中，搅拌使其充分溶解，配制成质量浓度为1 mg/mL的BiS溶液备用。

..BiS@PDA钠米颗粒的合成

(1)用H0503型精密电子天平分别精准称取4.5 mg盐酸多巴胺、6.2 mg FeCl·6HO，然后依次放入130 mL超纯水中，搅拌使其充分溶解。然后加入6 mL“1.2.1”配制的1 mg/mL BiS溶液，搅拌使其充分反应，搅拌时间为1 h；

(2)用电子天平金精准称取450 mg三氨基甲烷，放入20 mL超纯水中，搅拌使其充分溶解。配制成为pH值为9.6左右的Tris缓冲液；

(3)将以上两个步骤溶液混合，在室温条件下充分搅拌，搅拌时间为2 h；

(4)将反应产物置于高速离心机中，在10r/min转速下离心洗涤3次，每次洗涤时间为10 min。然后溶解于体积一定的超纯水中，配制成1 mg/mL的 BiS@PDA溶液备用。

..BiS@PDA-Gd钠米颗粒的合成

(1)将浓度为0.1 mol/L的GdCl溶液100 μL，倒入10 mL质量浓度为1 mg/mL的 BiS@PDA溶液中，搅拌使其混合均匀，搅拌时间为1 h；

(2)将产物置于高速离心机中，在10r/min转速下离心洗涤2次，然后溶于体积一定的超纯水中备用。

1.3 Bi2S3@PDA-Gd3+表征

..紫外可见光吸收

用U-T6型紫外/可见光分光光度计测定BiS和BiS@PDA的紫外-可见光吸收。

..Zeta 电位

用LS-POP(9)型激光粒度仪测定 BiS@PDA和BiS@PDA-Gd的Zeta 电位和水合粒径分布。

1.4 Bi2S3@PDA-Gd3+应用

体外光生成像试验

(1)分别取质量浓度为1、0.5、0.25、0.125和0.062 5 mg/mL的BiS@PDA-Gd溶液各200 μL，将其放入200 μL的PCR管中，超纯水为空白对照组；

(2)用Nexus 128学成像仪，在800 nm 近红外脉冲激光条件下进行光生信号测试。

..体外磁共振T1成像试验

(1)分别取质量浓度为400、200、100、50、25、12.5和6.25 mg/mL的BiS@PDA-Gd溶液各200 μL。放入200 μL的PCR管中，超纯水为空白对照组；

(2)用uMR 560型临床前紧凑型磁共振成像仪进行磁共振成像试验。

1.5 动物试验

体内光学成像

在Hela 荷瘤裸鼠的尾部注射质量浓度为10 mg/mL的BiS@PDA-Gd的PBS溶液200 μL。然后分别在注射0、2、4、8、24 h后，对Hela 荷瘤裸鼠用800 nm 近红外脉冲激光进行光声成像。

..体内磁共振T1成像

在Hela 荷瘤裸鼠的尾部注射质量浓度为10 mg/mL的BiS@PDA-Gd的PBS溶液200 μL。然后分别在注射0、4、8、24 h后，对Hela 荷瘤裸鼠在T1磁场中进行磁共振成像试验。试验时，TR和TE分别为446 ms和15 ms。

2 结果与讨论

2.1 Bi2S3@PDA-Gd3+表征分析

..紫外可见光吸收表征

图1为BiS和BiS@PDA的紫外-可见光吸收图，插图a、b分别为BiS和BiS@PDA的水溶液图。

由图1可知，BiS溶液表现为棕黄色；而BiS@PDA的颜色则表现蓝黑色。观察图中曲线可知，BiS在近红外区域吸收较弱；BiS@PDA在近红外区域吸收明显的增加，且在650 nm左右出现明显吸收峰。研究发现，碱性条件下，用Fe合成的PDA会在710 nm左右出现吸收峰。因此初步判定，BiS和PDA成功复合，且BiS对PDA吸收峰产生影响，使其出现蓝移的现象。

图1 Bi2S3和Bi2S3@PDA的紫外-可见光吸收图

..粒径分布和Zeta电位

图2、图3分别为BiS、BiS@PDA的粒径分布图和BiS、BiS@PDA、BiS@PDA-Gd的Zeta电位图。

图2 Bi2S3、Bi2S3@PDA的粒径分布图

图3 Bi2S3、Bi2S3@PDA、Bi2S3@PDA-Gd3+的Zeta电位图

由图2、图3可知，BiS的平均粒径比BiS@PDA的平均粒径低40 nm左右。BiSNPs的Zeta电位为-11.65 mV；BiS@PDANPs的Zeta电位为-31.89 mV、BiS@PDA-GdNPs的Zeta电位为-19.54 mV；BiS@PDANPs的Zeta电位远高于BiSNPs的Zeta电位。这是因为在 BiS外包覆着一层PDA，PDA表面具有丰富的—OH，使得BiS@PDANPs表现出较强负电。而BiS@PDA-Gd的Zeta电位低于BiS@PDA，这是因为和Gd螯合的过程中，PDA表面的—OH被消耗掉一部分，因此BiS@PDA-GdZeta电位相对降低。这也就说明了BiSNPs，PDA 层和 Gd成功复合。

2.2 Bi2S3@PDA-Gd3+应用

体外光生成像

不同质量浓度的BiS@PDA-Gd光学信号强度及其关系，具体如图4所示。

图4 不同质量浓度的Bi2S3@PDA-Gd3+光学信号强度及其关系

由图4可知，光学信号随BiS@PDA-Gd纳米材料质量浓度的增加逐渐增加，证实BiS@PDA-Gd纳米材料与光学强度间表现出线性关系。同时，也说明了该复合材料的分散性较好，能够用于体内光生成像。

..体外T磁共振成像

不同浓度的BiS@PDA-GdT1磁共振成像及其关系，结果如图5所示。

由图5可知，BiS@PDA-Gd纳米材料在T1模式下表现出优良成像效果，且成像亮度随BiS@PDA-Gd浓度的增加而逐渐增强；弛豫效率=12.04(mmol/L)·s。这就证实了Gd离子成功螯合在PDA层上，使其成为了优秀的T1造影剂。

图5 不同浓度的Bi2S3@PDA-Gd3+T1磁共振成像及其关系

2.3 动物试验

体内光声成像

图6为注射BiS@PDA-Gd的PBS溶液后，不同时间肿瘤位置的光声成像结果。

图6 注射Bi2S3@PDA-Gd3+的PBS溶液后不同时间肿瘤位置的光声成像结果

由图6可知，在2 h时，肿瘤部位有光生信号，光声强度大概为330.369 a.u.；在8 h时，光声信号达到最高，此时强度值大概为490.424 a.u.。随注射时间的增加，肿瘤部位的光声信号虽然有所减弱，但仍旧具备良好的光声信号。当注射时间为24 h时，光声强度值为412.059 a.u;这就说明，BiS@PDA-Gd纳米材料在体内光声成像仍旧表现良好，可用于体内光声成像。

..体内T1磁共振成像

图7为在T1模式下，注射BiS@PDA-Gd的PBS溶液后不同时间肿瘤位置的磁共振图像。

图7 T1模式下注射Bi2S3@PDA-Gd3+的PBS溶液后不同时间肿瘤位置的磁共振图像

由图7可知，T1模式下，注射BiS@PDA-Gd的PBS溶液4 h后，体内循环使得BiS@PDA-Gd在肿瘤位置处富集，使得该处亮度明显增加，进而帮助确定肿瘤的位置；当注射时间超过4 h，成像效果基本未发生改变。这就说明BiS@PDA-Gd纳米材料能够通过小鼠自身循环系统在肿瘤位置富集，且成像较为明显，能够成为新一代T1模式磁共振造影剂。

综合光声成像和T1磁共振成像结果，证实BiS@PDA-Gd纳米探针能够为肿瘤诊断及治疗都提供了更精准的技术手段。

3 结语

本文以表面自聚合方法，通过PDA的表面聚合，使其包覆BiS，得到BiS@PDA纳米材料。然后利用PDA表面的—OH，与具有MRI性能的Gd金属离子进行螯合，得到BiS@PDA-Gd复合纳米探针。通过体内外光声试验和T1磁共振试验对其性能进行表征，得到具体结论。

(1)UV-vis和Zeta电位结果表明，BiS@PDA比BiS的近红外区域吸收更强，且在650 nm左右出现了明显吸收峰。BiS@PDA的Zeta电位为-31.89 mV，明显高于BiS-11.65 mV，证实BiS与 PDA复合成功；而BiS@PDA-Gd的Zeta电位为-19.54 mV，明显低于BiS@PDA的Zeta电位。说明螯合后，Gd离子消耗掉PDA表面—OH，表明BiS、PDA和Gd离子复合成功；

(2)体外光声试验和体外T1磁共振试验结果表明，光声信号强度和T1磁共振强度与BiS@PDA-Gd浓度表现出线性关系。这就说明了BiS@PDA-Gd纳米材料具有良好的分散性，可成为优秀的T1造影剂；

(3)体内光声试验和体内T1磁共振试验结果表明，小鼠尾部静脉注射BiS@PDA-Gd8 h后，光声强度值最高为490.424 a.u.；注射时间为24 h时，BiS@PDA-Gd仍具备良好的光声信号。在T1模式下，注射4 h，BiS@PDA-Gd在肿瘤处富集，增加肿瘤明亮度，帮助确定肿瘤的位置；超过4 h后，成像效果改变不明显，证实BiS@PDA-Gd纳米探针能够成为新一代T1模式磁共振造影剂。