芥菜育种研究进展与展望

符 梅，陈 刚，唐 康,3，姜诗政,3，罗文龙，李桂花，郭巨先，骆善伟

（1.广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东 广州 510640；2.宁夏农林科学院农业资源与环境研究所，宁夏 银川 750002；3.华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642）

芥菜（Brassica junceaL.）是十字花科（Brassiceae）芸薹属（Brassica）植物，在进化过程中，芸薹属植物普遍发生了一次全基因组三倍乘事件（Whole genome triplication，WGT）［1］。芸薹属作物主要包括3 套原始基因组：白菜（Brassica rapa，AA 基因组）、黑芥（Brassica nigra，BB 基因组）和甘蓝（Brassica oleracea，CC 基因组）。芥菜属于异源四倍体（AABB，2n=4x=36），也称叶芥或印度芥菜，由白菜（A）和黑芥菜（B）基因组融合加倍形成［2］。芥菜作为重要的冬季油料作物和经济作物，于2016 年通过基因组测序，完成原始数据的拼装比对，获得基因组数据信息，其基因组大小为954.90 Mb。芥菜起源于中国，在我国栽培历史悠久、栽种面积广泛，不仅是一类重要的鲜食蔬菜，其根、茎和叶也能作为原材料加工成各类咸菜。芥菜由于其优良的耐干旱和耐高温能力，能在降水量较小的区域成为油菜的替代品种，作为菜籽油的主要提供者。芥菜变种十分丰富，其特有的营养品质、功能性成分以及重要变态器官的形成机理，均有待挖掘和解析，这些工作将进一步促进芥菜品种改良。作为重要的蔬菜品种，芥菜栽培研究及其基因功能研究开展历史已久，在育种、病害防治和基因功能研究领域也取得丰硕成果［3-5］。

遗传多样性是种内或种间个体基因型的差异导致，能够让每个物种适应多变的生活环境。无论环境的变化是自然因素还是人为因素所造成，这些基因的差异随着地理环境和区域的变化，通常会形成一个新的小群体进而产出新的等位基因，群体的遗传基因池随着物种的分布区域的改变而改变。当小群体发生基因交流时，这种基因多样化的积累会得到强化，随着进化时间的推移，基因池的累积将最终导致一个新物种的形成［6］。通过种质资源的收集和迁地保护，大量的芸薹属种质资源被遗传资源中心（CGN，荷兰）、园艺植物遗传研究所（IVT，荷兰）、园艺植物研究所（HRI，UK）和作物基因库研究所（UK）等机构收集。通过对单个或多个群体中的个体进行形态学特征的描述，可建立各个群体的形态图谱。由于基因型与表型之间的对应关系，传统的杂交育种可以利用这些优良的形态特征对栽培作物进行遗传改造，从而形成优良的栽培品种。

我国的芥菜资源丰富，其中涪陵榨菜、潮汕包心芥菜、惠州梅菜等都是广泛种植的芥菜品种。这些地方芥菜品种虽然品质较优，且产量较高［7-8］，但由于在传统的种子繁殖过程中易与芥菜的其他变种甚至与同属的白菜、甘蓝串花杂交，造成品种混杂、种性退化，严重影响其品质［9］。截至目前，对于地方芥菜品种的育种研究尚少［10］，如何对地方芥菜品种进行改良成为亟待解决的问题。本文通过对芥菜育种方法进行总结分析，探索可应用于地方芥菜品种育种的方法和思路。

1 芥菜诱变育种

诱变育种技术是通过使用各种外界理化因素对植物材料进行处理，使其基因组信息改变。诱变育种技术分为化学诱变和物理诱变，具有操作简单、育种周期短的优点，而且很多诱变手段不受材料本身的限制，可以利用种子、愈伤组织、枝条等。截至2022 年，全世界通过诱变技术获得的新品种达3 402 个，其中大多为粮食作物［11］。芥菜物理诱变育种采用较多的是γ射线辐射育种。Malek等［12］用60Co 产生的γ 射线对当地流行的芥菜品种BARIsarisha-11 进行辐射处理，单株收种后在M2群体中进行突变体筛选，经过4 代的连续筛选，在M4群体中获得10 个稳定的突变体，其中MM-10-04 和MM-08-04 与对照相比生物量分别增加23%和14%。化学诱变技术是指利用化学诱变剂对DNA 作用使其突变，其中甲基磺酸乙酯（EMS）是最常用的化学诱变剂［13］。Halder等［14］利用EMS 对芥菜进行诱变，获得对铅、铬和镉超量积累的芥菜突变体。虽然采用人工诱变的方法不可控制诱变方向，且工作量大，但可以创制新突变类型，在芥菜育种中仍然多有使用。

2 芥菜远缘杂交育种

我国拥有丰富的芥菜变种资源，但是不同芥菜变种间遗传背景差异较小，缺乏抗病、抗虫、抗逆性好的变种资源。为了丰富芥菜种质资源的遗传多样性、提高优良抗性，利用芸薹属植物的种间杂交成为丰富芥菜种质资源的有效途径。芸薹属作物具有较高的遗传多样性，其主要形成原因可能是：（1）具有不同遗传背景的亲本发生多次异源杂交事件产生异源多倍体；（2）基因组发生加倍事件。芸薹属植物中作为主要经济作物的物种主要有4 类：白菜（B.rapa）、芥菜（B.juncea）、埃塞俄比亚芥（B.carinata）和油菜（B.napus）。芸薹属包含多个叶菜品种，具有丰富的基因资源，为远缘杂交育种提供了基础。芸薹属作物叶片的形态、茎的分支性状和粗细程度、花序的形态都具有较大差异，这些差异可以运用于芥菜性状的改良。

远缘杂交育种技术迄今为止依然被认为是提高作物品质最有效的方法之一，野生种与芥菜的杂交工作已经在不同水平获得成功［15］。自然条件下，以5 200 万份油菜（B.napus，2n=38）作为母本、野芥菜（Raphanus raphanistrum，2n=18）作为花粉供体进行杂交，只产生2 个异源多倍体杂合体（2n=56），油菜和野芥菜的自然杂交率仅为4×10-8。虽然自然条件下远缘杂交发生的概率较低，但是也展示出芸薹属远缘杂交的可行性，通过人工干预控制杂交条件，可以提高这一事件发生的概率。利用人工干预的远缘杂交技术，Shashi等［16］改善了埃塞俄比亚芥种子中油的品质，使其高油酸含量达到49%，而且不含芥酸，这一过程主要是利用大白菜（AACC）和芥菜（AABB）作为改良埃塞俄比亚芥种子的原材料。远缘杂交技术除可改善作物品质外，还可用于芥菜抗病研究和雄性不育系的建立。

2.1 远缘杂交育种技术增强芥菜抗病能力

植物病害在全世界范围内都极大地影响作物产量，植物的抗病机制成为多种作物的研究重点，其中包括重要经济作物如水稻［17］、小麦［18］和油菜［19］等。与此同时，芥菜的病害相关研究也取得长足进步。植物抗病基因主要分为质量性状基因、数量性状基因两种类型。质量性状是通过单个基因提供较高的抗病性［20］，数量性状通常是几个主效基因共同行使功能，每个主效基因发挥部分作用，共同作用增强植物抗病能力［21-22］。

芥菜常见的病害包括黑腿病（Leptosphaeria maculans，L.biglobosa）、核盘菌茎腐病（Sclerotinia sclerotiorum）、白锈病（Albugo candida）、叶枯病（Alternaria brassicae，A.brassicicola，A.raphani）、白叶斑病（Pseudocercosporella capsellae）、霜霉病（Hyaloperonospora brassicae）、白 粉病（Hyaloperonospora brassicae）、白叶枯病（Pseudomonas syringae）、黑腐病（Xanthomonas campestris）、叶疫病（Pseudomonas syringae）、芜菁黄化病（Beet western yellows virus）、花椰菜花叶病毒（Caulif lower mosaic virus）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus）等［8］。这些芥菜常见病主要分为真菌与卵菌病、细菌病和病毒病三大类。通常来说，芥菜比油菜具有更高的黑腿病抗性，受黑腿病的影响而引起的减产也较油菜轻。因此，Chevre等［23］利用芥菜卡诺拉作为抗性基因的供体与油菜卡诺拉进行杂交，通过选育获得具有稳定RIM6 抗性基因的油菜；但该基因并没有对引起黑腿病的另一种病菌L.maculans表现出良好抗性，而且该病菌已经成为黑腿病的主要致病菌［24］。对于菌核病的防治，也可以通过远缘杂交的方式提高芥菜抗性。2017 年，Rana等［25］利用野生的十字花科植物Brassicaceae fruticulosa与芥菜进行杂交从而引入菌核病的抗病基因，并且建立了10 个连锁显著的标记。随后，Atri等［26］延续前人的工作，通过GWAS 技术确定了抗性基因的位点，他们在7 个染色体上鉴定出13 个显著位点，并且获得与菌核病抗性相关的20 个候选基因，这些候选基因属于一些主要的抗病蛋白家族，包括TIR-NBS-LRR 家族、几丁质酶、malectin/受体样蛋白激酶、防御素类（DEFL）、脱硫硫甙硫转移酶蛋白和脂氧合酶。通过远缘杂交技术不仅能够将具有抗性品种的抗性基因转移到目标品种中，提高目标品种对病害的抗性，而且结合现代分子生物学技术能够进一步找到抗性基因，解释其抗病机制。Rana等［25］发展了一套芥菜与E.cardaminoides基因导入体系，基于SSR 分子标记技术鉴定出6 个在A 和B 基因组中都有的抗性标记位点，通过使用GWAS 技术探究这些基因抵抗菌核病的作用机制，找到信号传导通路以及抗真菌的蛋白和代谢物。抗菌核病基因包括编码LRR 蛋白激酶家族蛋白的LRR-RLK 基因、与病原体相关分子模式相关的遗传因子（PAMPs）和效应物触发免疫（ETI）相关基因。利用远缘杂交技术将抗性基因导入芥菜中的研究虽然已卓有成效，然而尚有许多芥菜高发病缺乏相应的抗性基因，这部分工作仍需继续进行。此外，对于一些病毒病如芜菁花叶病毒和花椰菜花叶病毒，芸薹属缺乏相应的抗性基因，需要寻求其他方式进行改良。

2.2 远缘杂交育种技术建立芥菜雄性不育系

芸薹属近源种的另一个应用是构建不育系用于杂交育种，常用的杂种优势利用途径包括细胞核雄性不育（GMS）、细胞质雄性不育（CMS）和自交不亲和（SI）［27］。利用雄性不育创制的杂交种，其杂种优势已在多种作物中得到体现，且在育种领域得到广泛应用［28］。通过外源物种作为供体将细胞质转移到另一个物种中，采用这种方法获得的不育系称为细胞质雄性不育。科学家利用原生质体融合技术，将芥菜（2n=35；AABB）的细胞核导入B.fruticulosa细胞质中，构建了新的CMS 不育系，该不育系雄性不育完全、稳定，表现为含有不育花粉粒的发育花药，且未对花和植株的其他性状产生影响，并且可通过细胞质供体中导入育性基因恢复育性［27］。原生质体融合技术也被运用于雄性不育的构建，通过原生质体融合技术将西蓝花的细胞质雄性不育和大丽黄萎病的抗性基因导入到芥菜中，获得拥有正常花瓣和雄蕊的再生植株，能够产生花粉和结实［29］。邹瑞昌等［30］利用芥菜型油菜细胞质雄性不育型hauCMS（00-6-102A）与多个区域（上海、浙江、重庆、武汉和贵州）的常规芥菜品种杂交，经多代回交纯合获得5 个叶用不育系。章时蕃等［31］以萝卜质雄性不育大白菜为不育源、以结球芥菜及长柄芥菜为父本，通过杂交、连续回交的方法育成结球芥及长柄芥不育系，该不育系植株及花器官生长正常，雄性不育度达到100%，且育性稳定，不受环境影响；利用该不育系配制的杂交组合表现出明显的杂种优势，且杂交制种产量正常。截至目前，利用远缘杂交技术和细胞融合技术，已经构建了多个芥菜不育品系，为芥菜杂交育种提供了便利。

3 芥菜转基因育种

遗传转化技术提供了一个直接的品种改良解决方案，通过将特定的目标性状基因直接导入到目标材料，对特定性状进行定向改良。遗传转化体系在多种芸薹属植物中已经建立，包括黑芥菜［32］、埃塞俄比亚芥菜和白菜［33］。遗传转化技术在提高芸薹属作物多样化研究中具有重要作用，利用该技术导入的基因能够跨越芸薹属本身的限制，导入的基因不仅可以是芸薹属的，也可以是其他作物甚至微生物的。以往研究中发现，通过遗传转化技术引入外源基因，能够促使芸薹属植物产生诸如降解塑料、合成药物和其他营养物质的功能［34］。Stoutjesdijk等［35］通过构建携带油酸脱氢酶基因的共抑制质粒，以农杆菌作为植物遗传转化媒介，将潮霉素抗性基因作为标记，将芥菜中内源的油酸脱氢酶基因沉默，从而实现提高油酸含量的目的，其油酸含量提高73%。利用转基因技术也能帮助构建雄性不育体系，将携带有特异的tapetum 启动子的barnase基因转入到芥菜中从而获得雄性不育植株，该不育系的育性可以通过与携带有barstar基因的转基因株系进行杂交获得［36］。采用农杆菌介导转化法在芥菜中过表达DWF4基因，能够促进植株生长，株高、开展度、最大叶长和最大叶宽显著大于对照，并且抽薹时间和开花时间提前，表现出更强的生长势［37］。利用转基因技术还能提高芥菜的抗虫能力，Das等［38］将来源于芋头的块茎凝集素（CEA）基因转到 芥菜B.junceacv.B85 中，使CEA 蛋白在转基因植株的可溶性蛋白中占比0.20%～0.47%，并且转基因芥菜植株上蚜虫的死亡率比非转基因植株提高70.00%～81.67%，蚜虫的繁殖能力降低49.35%～62.11%。通过生物信息学分析，免疫筛查和BALN/c 老鼠模型实验发现CEA 蛋白并不会引起过敏反应。另一项研究中，芥菜B.junceacv.B85 过表达线虫抗性基因RIHSPRO2，使得线虫死亡率增加45%、蚜虫死亡率达45.6%［39］。Rani等［40］提出一种多毒素工程方法，将一个融合基因导入B.junceacv.Varuna，在韧皮部特异性启动子rolC的作用下表达了扁豆凝集素基因和鹰嘴豆蛋白酶抑制剂基因，提高蚜虫抗性；芥菜蚜虫从植物的韧皮部吸食汁液，而导入的基因在韧皮部特异性表达；蚜虫生物试验中，转基因植株的幼虫存活率下降到40%，对叶片的损害也比对照植株小。转基因技术除用于抗虫研究，在抗病领域也有应用。Tasleem等［41］利用MPK3基因转化了B.juncea，分析其对Alternaria brassicae的耐受性，并且评估转基因植物中抗氧化酶的活性。结果发现，与对照相比，抗坏血酸过氧化物酶（APX）和愈创木酚过氧化物酶活性以及脯氨酸含量均提高，从而增加转基因植物清除由于Alternaria感染而产生活性氧的能力。转基因技术虽然可以快速而且直接解决生产上的问题，但是其对环境的影响还需进一步研究，消费者对转基因蔬菜的接受也需要一个过程［42］。转基因技术为芥菜的基因功能研究提供了巨大帮助，然而由于当前国内政策原因，芥菜转基因育种尚处于技术储备阶段。

4 芥菜基因编辑育种

基因编辑技术由于其精准的基因编辑能力，在基础研究和作物育种工作中展现了广阔的应用前景。基因编辑技术主要包括3 类：锌指酶（Zinc finger nuclease，ZEN）、转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator like effector nuclease，TALEN）和CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat-CRISPR associated protein 9）［43］。ZFN 和TALEN技术由于在实际操作中具有难度较大、耗时较长等缺点，其应用受到限制［44］，而CRISPR/Cas9是一种具有开创性的基因组编辑系统，该系统具有易操作、编辑效率高和适用范围广等特点，在育种领域得到广泛的认可和使用［45］。Cas9 蛋白通过RNA-DNA 碱基对识别PAM（Proto-spaceradjacent motif）区域上游的特定DNA 位点进行切割，实现其基因编辑功能。虽然Cas 基因核心原件可以分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三大类，但由于Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas 系统需要多个Cas 蛋白才能形成切割复合体，而Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统只需Cas9 蛋白就能完成对DNA 双链的切割工作，因此Ⅱ型CRISPR/Cas9 成为最常用的人工核酸酶系统［46］。近年来，能够定向改变基因组的分子技术CRISPR/Cas9 已应用于多种作物研究［47-48］。研究人员采用CRISPR/Cas9 技术分别对芸薹属作物油菜［49］和卷心菜［50］的M 位点蛋白激酶和S-受体激酶进行编辑，干扰其基因功能，实现了孢子体自交不亲和。Wang等［51］利用CRISPR/Cas 将油菜内源EPSPS 替换成EPSPSmTIPS 和SPSPSmLFGAAGMCRL，创制了抗草甘膦的油菜新品系。芥菜存在一类过敏物质Bra j I蛋白，Assou等［52］利用CRISPR/Cas9 系统对黑芥的Bra j I基因进行编辑，一共获得4个Bra j I等位基因大片段缺失（缺失片段566～790 bp）的株系，并且通过CRISPR/Cas9 获得的突变植株的性状大多表现为可遗传，这些突变株的Bra j l蛋白含量显著降低。由于CRISPR/Cas9 技术优异的基因编辑能力，在芥菜基础研究和育种领域的应用必将越来越广泛，为以往难以解决的科学问题提供了新的解决方案。

5 芥菜分子标记技术辅助育种

分子标记是根据个体或种群间核苷酸序列的差异作为遗传标记，能够用于评估植物个体间的遗传多样性和亲缘关系，辅助芥菜种质资源库的建设。目前，多种分子标记技术已经开发用于植物的遗传育种研究，如随机扩增DNA 多态性（RAPD）、限制性片段长度多态性（RFLP）、扩增长度多态性（AFLP）、微卫星序列标记（SSR）和单核苷酸多态性（SNP）。由于RAPD 技术和RFLP 技术的简便性，目前芥菜育种中常用的分子标记多基于RAPD 和RFLP，而基于基因序列的分子标记技术如SSR、SNP 具有更加广泛的应用范围［53-54］。

5.1 分子标记技术辅助建库

RAPD 技术是基于随机引物在基因组DNA 上的随机结合位点，根据DNA 序列的差别扩增获得差异片段。Frello等［55］利用RAPD 技术分析芥菜（母本）与油菜（父本）杂交后代基因的遗传特点，发现杂交后代表现出19%～93%的多态性，并且用RAPD 技术分析杂交后代的花粉与亲本的相似性，选择与父本基因相似的杂交后代的花粉进行回交，有效减小了回交的群体大小和回交的世代。Rabbani等［56］利用RAPD 技术对收集的198 份芥菜遗传亲缘关系进行鉴定，并通过对RAPD 结果的聚类分析，获得各地区芥菜品种的遗传特点。Srivastava等［57］使用AFLP 技术对由21 个自然品系和9 个组合品系组成的芥菜群体进行遗传多态性分析，一共获得778 个多态性条带，每对引物平均产生37 个多态性条带，进一步从中获得4 对多态性条带最为丰富的引物，能够高效完成芥菜群体的区分鉴别。Thakur等［58］利用SSR 技术揭示了3 个二倍体和3 个异源四倍体芸薹属作物的遗传特征，研究中将芸芥（Eruca sativa）作为离群值，通过NJ-基础的系统树图将40 个芸薹属植物分为两大类，一类包含芥菜、黑芥、大白菜，另一类包含埃塞俄比亚芥、油菜、甘蓝，研究结果还表明C-基因组的芸薹属植物保留了相对于A-基因组和B-基因组更高的保守性，芥菜和大白菜中的A-基因组更加原始。使用分子标记技术，能够从基因水平对芥菜各个亚种进行鉴定和分类，为我国丰富的芥菜资源的归类提供了巨大帮助。

5.2 分子标记技术辅助育种

分子标记技术除可以进行多态性分析外，还可用于辅助育种工作者进行基因鉴定。利用分子标记技术可以克隆定位关键基因或QTL、开发功能标记，并将全基因组辅助育种技术广泛应用到芥菜的材料创制、优势预测、定向改良等工作中，建立和完善芥菜分子和基因组辅助育种技术体系。分子标记技术可用于标记非生物胁迫相关基因，Fusco等［59］采用以cDNA 为基础的AFLP技术，对镉处理芥菜的基因表达进行分析，一共获得对镉胁迫有响应的基因73 个，其中52 个基因功能已知、10 个基因功能未知，还有11 个基因没有匹配到相应的基因库。SSR 技术是基于基因组中的微卫星重复序列设计，具有操作相对简单、可重复性强的特点。Sharma等［60］利用155个SSR 引物标记芥菜的482 个等位基因，Singh等［61］开发了芥菜中与非生物胁迫相关的miRNAs的SSR 标记，为分子标记辅助筛选芥菜抗非生物胁迫品种奠定了基础。SNP 技术是基于作物的基因组信息，通过多样本比对分析，获得每个样本相同基因某一位点的单核苷酸多态性。SNP 技术是基于基因组信息开发的标记，需要高质量参考基因组，随着测序技术的发展，SNP 技术必然会得到更加广泛的应用。通过基因组重测序，已经获得白菜和甘蓝两个物种间892 536个SNP位点，这些SNP 位点可以作为白菜和甘蓝杂交育种的重要筛选标记［62］。利用SNP 技术可以对抗病基因进行鉴定，Atri等［63］采用SNP 技术构建了20 个候选基因，并对芥菜品系中通过外源引入的抗性基因进行定位，为芥菜育种提供便利。Rana等［64］采用SNP技术鉴定芥菜对菌核病的关键抗性基因，为后续抗性基因的深入研究提供基础。Raman等［65-67］利用6 464 个高质量、具有染色体位置信息的多态性DArTseq 标记，对300 个BC73526（果荚不易破碎）和BC73524（果荚易破碎）杂交的F2群体进行筛选，最终获得5 个与果荚破碎性状紧密关联的QTL（LOD ≥3），分别分布于B1、B3、B8、C5 染色体。随着测序技术的发展，芥菜基因组信息的完善以及性状连锁基因的挖掘，分子标记技术辅助分子育种必将获得越来越广泛的应用。高质量的性状连锁基因的挖掘仍然是分子标记育种的核心，如何寻找与性状紧密关联的基因仍然是研究的重点和难点，尤其是一些地方芥菜品种的基因组信息不明确，增加了分子标记育种的使用难度。

6 结论与展望

芥菜是我国特色蔬菜产业技术体系中的一部分，芥菜品种改良、芥菜类蔬菜的种子生产、芥菜育种技术的开发等工作都亟需改进。本文总结了芥菜育种的常规技术手段，包括诱变育种技术、远缘杂交育种技术、转基因育种技术、基因编辑育种技术和分子标记技术，同时对应用以上技术的原理及所取得的成果进行综述，尤其是对近几年应用这些技术开展的芥菜育种工作进行了介绍。芥菜种植遇到的传统问题尚未完全解决，一些新问题又出现了，如芥菜种植遇到新的流行病以及全球气候变化带来的极端天气情况增加，需要抗逆性更强的新品种；劳动力成本增加，需要能够进行机械化操作的新品种等。这些新问题的出现，迫使育种技术向前发展，推动育种工作者进行芥菜新品种的培育以应对新的困难。

芥菜存在许多地方品种，这些地方品种由于长期自留种、环境变化等原因造成种性退化或者难以适应生产需求，亟需育种工作者对其进行改良。本文通过对芥菜育种的常用技术及采用此技术获得的成果进行总结，为地方品种的改良提供参考和借鉴。芥菜地方品种的改良任重道远，常规提纯复壮往往不能满足生产上的需求，因此采用先进育种技术将是必由之路。采用诱变育种技术，能够改变地方品种的一些不良特征；采用远缘杂交技术能够增加地方品种的抗病性和抗逆性；利用转基因技术和基因编辑技术将能够定向改变地方品种的某个基因，可以增加地方品种的风味物质，也能减少地方品种不良物质的积累；利用分子标记辅助育种将能够快速将有利性状基因整合到地方品种中，有利于快速改良地方品种的不良性状。