PET塑料废弃物及微塑料生物降解与转化的研究现状与展望

刘欣悦，崔颖璐

(1.中国科学院微生物研究所 微生物资源前期开发国家重点实验室 生理与代谢工程重点实验室，北京 100101；2.中国科学技术大学 生命科学学院，安徽 合肥 230026)

自20世纪50年代以来，塑料以其无限的创新潜力塑造了世界，为人类快速变化的需求提供可持续解决方案，已成为现代社会中不可或缺的一部分[1]。2019年，全球塑料产量达到了3.68亿t[1]，预计到2040年，行业规模将进一步增大，达到每年8亿t[2]，其中，大约有40%的塑料包装垃圾会被填埋，而32%的塑料将会从收集系统中逃脱[3]。据统计，每年至少有800万t塑料进入海洋[3]，这些难以自然降解的塑料在环境中可存在数十年甚至上百年，对生态环境造成长期、深层次的危害[4]。更令人担忧的是，这些暴露的塑料制品在物理作用、光降解等过程影响下，可形成粒径小、比表面积大、疏水性强的微塑料(microplastics)。目前在全球海洋塑料垃圾中，大约有92.4%是微塑料[5]，即粒径小于5 mm的塑料颗粒[6]。一些研究指出，微塑料的吸附能力很强，可以作为重金属和其他有毒化学物质在不同自然生态系统中运输的载体[7-9]。随着2019年以来新冠肺炎的暴发和流行，个人防护装备的使用导致了大量塑料垃圾的产生。据统计，疫情可能导致全球每月使用1 290亿个口罩和650亿只手套[10],一旦处置不当，将会加剧微塑料处理难度。

1 聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)概述

PET是应用最广泛的聚酯塑料之一，年生产量超过3 000万t[11]。具有优异物理性能的PET被大量用于生产一次性包装产品，而这些材料在消费后即成为塑料垃圾，给全球生态系统带来了严重负担[12]。目前，发展中国家采用的PET处理方法主要是填埋和焚烧。由于空间稀缺和成本增加，填埋处理法不能长期进行，而焚烧处理会排放含有各种毒物和飞灰的有毒烟雾，需要进一步的处理[13]。相比之下，使用更少的能源和资源并能降低碳排放的回收方法被认为是管理PET废物的最佳方式之一[14]，主要有物理法和化学法。物理法可将回收的PET塑料经分类、研磨、加热等工艺再次制造成粒，但是这种向下循环的方法，大约6次循环之后，就不能再次回收[15]。此外，由于污染物的存在以及光氧化等作用可能会极大地改变PET性能，所以形成的产品质量往往较差，对物理回收的可行性有着极大阻碍[16-17]。另一种则是化学法，通过糖解、醇解、水解和氨解等方法将PET废料进行化学解聚，从而能够回收可用于再合成的单体或反应中间体，但其建立在高温或使用极端化学试剂的基础上，成本昂贵、容易产生二次污染[18]。因此，寻求新型的环境友好的PET回收方法已成为环境治理的迫切客观需求，而利用生物法(如酶或微生物降解)将PET降解成对苯二甲酸单羟乙酯(MHET)、对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)、乙二醇(EG)和对苯二甲酸(TPA)等组分，然后回收再利用是最理想的方法，也是近年来的研究重点。该方法不仅避免了对环境的二次污染，还能大幅降低处理成本，为绿色环保地解决PET废弃污染提供新契机[19-20]。

目前已筛选到多种能降解PET的细菌、真菌及微生物菌群，并从中挖掘出数十种PET降解酶[21-22]，它们对于难以收集的微塑料或可回收的PET废弃物的降解都起着重要的作用。同时，研究人员长期致力于对不同PET降解酶进行改造，以满足不同目的的应用需求。

2 PET降解酶的发展与现状

2.1 可回收PET塑料的生物降解及循环再利用

由PET制成的饮料瓶等回收率非常高[23]，对于这些易于收集的PET废物，通过生物降解对其进行异位处理有着广阔的应用前景。因为PET在水溶液中的玻璃转化温度(Tg)为65 ℃左右，在该温度下，PET塑料的非晶态部分具有更高的柔性，从而更易被酶接触并发生解聚。直接利用嗜热性PET降解酶在高温(60～70 ℃)条件下对PET进行解聚成为近年来研究的热点，例如LCC、TfCut2、Cut190和HiC等在70 ℃下对PET均有着较高的降解活性。Then等[24]通过引入盐桥或二硫桥代替TfCut2酶中的Ca2+结合位点来提高酶的热稳定性，使TfCut2突变体能够在70 ℃反应48 h，使PET薄膜损失了25.0%±0.8%。Kawabata等[25]通过半理性设计发现，相较于增加疏水性(Q138L)或环境负电荷(Q138D)，增加底物结合空间(Q138A)更能提高Cut190酶降解性能。之后该研究小组又在其第2位Ca2+结合位点引入二硫键，最后所获熔融温度(Tm)值升高的突变体在70 ℃下使PET薄膜降解达到30%以上[26]。由于PET降解产生的中间产物双-对苯二甲酸羟乙酯(BHET)和对苯一甲酸乙二醇酯(MHET)是PET降解酶的竞争性抑制剂，会限制PET进一步降解[27]。Wei等[28]对TfCut2参与底物结合的氨基酸进行突变，得到的G62A突变体对MHET的结合力减少了5.5倍，从而使酶能在50 h内降解超过42%的PET薄膜，与野生型相比增加了2.7倍。

由于可以集中回收并处理，生物降解后的单体对苯二甲酸(TPA)可被重新利用进行PET合成，实现PET闭合循环再利用。Tournier等[29]使用LCC突变体(ICCG)在10 h内实现了至少90% PET废弃物的解聚，并获得了高水平的TPA生产率。随后，该研究小组通过工业方法获得了纯度99.8%以上的TPA单体，并通过反应重新合成“初生型”PET。由此PET生产的吹制新瓶子，表现出比商用PET瓶子更好的亮度和相似的力学特性，从而创造了一个闭环回收过程。包括LCC突变体在内，至少有4种候选的PET水解酶在PET的生物回收中有可行的应用[30-31]，表1展示了可用于PET回收的嗜热性角质酶类型和降解能力。

表1 可用于PET回收的嗜热性角质酶类型和降解能力

然而，想要通过降解酶实现PET回收的共同目标，还需要对降解酶和降解工艺进行进一步优化。例如，酶基因和表达宿主的工程优化，酶作为全细胞催化剂的微生物底盘的选择[32]以及PET机械预处理、反应条件改善[33-34]等。除了大肠杆菌外，这些PET降解酶已经在Bacillusmegaterium[35]、Streptomycesrimosus[36]、B.subtilis[37-38]、Pichiapastoris[39-40]和Clostridiumthermocellum[41]等宿主中进行过表达。Shirke等[39]在Pichiapastoris中表达了LCC，并将天然LCC的3个N-糖基化位点糖基化，得到热稳定性提高的糖基化LCC。Wei等[38]研究发现，在Bacillussubtilis中表达的TfCut2比在大肠杆菌中表达具有更高的热稳定性和活性。

综上所述，能够在PET的玻璃转化温度下进行反应的嗜热性角质酶在PET废物的生物回收方面发挥着重要作用，其中LCC突变体最接近实际应用。目前，通过酶法对PET进行生物回收在经济上的可行性很大程度上取决于回收成本、系统性解聚工艺以及石油的价格。油价越低，基于石化产品的塑料材料相对于再生塑料在价格上就更有竞争力，反之，则PET生物回收的可行性越高。

2.2 不可回收PET塑料的生物降解

2016年，日本学者Yoshida等[43]分离出一种以PET为主要能源和碳源的细菌Ideonellasakaiensis201-F6，并从中获得了对PET有降解活性的水解酶PETase和MHETase(图1)。值得注意的是，这种新型PET水解酶与放线菌角质酶有45%～53%的氨基酸序列同源性[44]，但能够在30 ℃下作用6周后使1.9%结晶度的PET膜完全降解，是其他PET水解酶降解效率的120倍，极大拓宽了微塑料原位生物降解的潜力。但野生型PETase的稳定性较低，距离这一目标的实现还有很大距离，为此，对于PETase同源酶的挖掘以及改造等研究都是十分必要的。

图1 PET水解及PETase和MHETase在水解过程中的作用[43]

Almeida等[45]通过生物信息学方法从Streptomycessp.SM14中鉴定出一种具有聚酯降解活性的类似PETase的酶SM14est，该酶氨基酸序列与PETase具有41%的同源性，但其对PET的降解能力还有待研究。Bollinger等[46]则筛选了一种能够以PET为底物的酶(PE-H)，该酶来自海洋细菌Pseudomonasaestusnigri，在30 ℃下反应48 h后，能水解PET产生(4.2±1.6)mg/L MHET。近期，Sagong等[47]从Rhizobactergummiphilus中分离出一种与PETase同源性为72%的酶(RgPETase)，RgPETase具有PETase的关键结构特征，在常温下对微晶PET表现出与PETase相似的PET水解活性，但其对低结晶度的PET降解活性要低于PETase。

目前已有多个团队先后报道了PETase的高分辨率晶体结构，相较于对PETase同源的中温PET降解酶的挖掘，对PETase进行功能改造取得了更多的进展[34]。PETase具有典型的α/β水解酶折叠方式，但它还具有许多独有的特征，使其适合于在中温条件下对PET进行降解。PETase在活性位点附近具有一个特殊的二硫键DS1[48](图2(a))，连接PETase特有的一段loop区。Fecker等[49]通过分子动力学模拟证明，DS1的断裂将会损害催化三联体的完整性，DS1缺失的突变体丧失了PET降解活性。与其他降解酶相比，PETase的β8-α6环中有3个额外的残基(Asn244、Ser245和Asn246)(图2(b))，能够延伸底物结合口袋的裂隙来提供足够大的空间容纳PET。同时PETase口袋附近的丝氨酸残基的位阻较小，所产生的较宽的口袋能有利于PET大分子进入催化中心，而传统角质酶相应位置则是具有更大空间位阻的Phe残基[50](图2(c))。但Austin等[51]根据同源角质酶的保守位点，构建出具有缩小活性位点结合口袋的突变体S238F/W159H，该突变体在降低PET结晶度和产物释放方面都优于野生型。Ma等[52]将底物结合口袋周围的关键残基进行突变，用无细胞表达系统筛选得到的I179F突变体的酶活性比野生型提高了2.5倍，对PET薄膜的降解速率能达到22.5 mg/(μmol·L·d)。除此之外，在PETase的结构中观察到了W185的摆动现象，这也使得底物结合区域变得开阔，从而可以容纳更大的PET分子[48](图2(d))。Chen等[53]将其他角质酶中保守的His/Phe残基突变为PETase中W185下方侧链基团较小的小二元体Ser/Ile，获得了降解活性提高的突变体。

(a)红圈内为PETase特有二硫键DS1。(b)PETase独有的NSN-loop(深红色部位)在表面形成底物结合沟槽，而在TfCut2上该沟槽被阻断。(c)PETase和TfCut2保守的催化三联体与不保守的Trp/Ser和His/Phe残基。(d)PETase的W185所在loop具有更大柔性图中的蛋白颜色用于区分温度因子(B-factor)：蓝色表示温度因子较低，结构更加稳定；绿色表示温度因子较高，结构柔性较大。

这些单/双位点突变的研究虽然有了一定成果，但通过改造对PET 降解能力的提升还有着广阔的发展空间。近期，笔者课题组设计了一种新的计算策略——蛋白质工程的贪婪累积策略(GRAPE)[54](图3)，基于计算机蛋白质设计对PETase进行了稳定性改造，获得了鲁棒性显著增强的重设计酶。这项策略融合了多项单点预测算法进行优势互补，再对实验验证的有益突变体进行聚类分析，并结合贪婪算法进行迭代叠加，可大幅规避不同突变位点间的负协同效应，从而在较短时间内最大限度地探索出叠加路径。具体过程：首先，采用融合策略，综合使用4种不同的单点预测算法辅以结构缺陷分析，预测了85个潜在有益突变。随后，对预测突变进行了实验检验，获得了21个有益单点突变(ΔTm≥ 1.5 ℃)。通过K-means聚类算法，再将21个有益单点突变分为3个Cluster，并依据贪婪算法对每个Cluster进行迭代叠加，经过10轮迭代叠加，成功获得熔融温度提高31 ℃的IsPETase突变体(S214H-I168R-W159H-S188Q-R280A-A180I-G165A-Q119Y-L117F-T140D，命名为DuraPETase)。经研究发现：DuraPETase在 60 ℃高温下耐受3 d后仍保留活性；而野生型PETase在37 ℃下仅经过12 h便完全失去PET降解活性。在37 ℃下，DuraPETase对30%结晶度PET薄膜的降解效率相较于野生型提升了300倍。通过扫描电镜可观察到，经DuraPETase处理后的PET薄膜内部结构发生了显著的腐蚀变化。随后，对DuraPETase蛋白晶体结构进行解析，验证突变体活性位点区域氨基酸之间协同相互作用，探究了DuraPETase性能改善的分子机制，实现了2 g/L微塑料在温和条件下的完全降解。这项工作为计算机辅助蛋白质改造提供了新思路的同时，也为微塑料的原位处理的进一步发展提供了有力支持。

除了对PETase全局骨架进行改造之外，还可通过对PETase进行表面修饰来提高其降解活性。Chen等[55]将4种单体修饰到PETase上，获得了具有更优的酶活性、热稳定性和pH稳定性的蛋白，其中，TBMA-PETase和DMAEMA-PETase对PET膜的生物降解效率分别是PETase的4.7和3.3倍。此外，该研究团队还尝试将由谷氨酸(E)和赖氨酸(K)残基组成的两性离子多肽融合到PETase的C末端，结果发现增加融合肽的长度可以提高催化性能，PETase-EK30降解高结晶度PET薄膜的产物释放量是野生型的11倍以上[56]。通过将PETase转入工程菌进行全细胞催化，再将降解单体转化为高价值产品，是实现PET塑料循环经济的有效途径。近期，Liu等[57]建立了一个用于耦合PET降解和聚羟基丁酸(PHB)生产的共培养系统，将表达PETase的YarrowialipolyticaPo1f和TPA降解菌株PseudomonasstutzeriTPA3一同培养生成PHB。该研究为PET的生物降解和升级利用提供了一种完整的生物处理策略。

MHETase也是从Ideonellasakaiensis201-F6分离出的一种的α/β水解酶，该酶负责PET降解的最后一步，将PETase中间产物MHET降解为TPA和EG[43]。目前，已解析出MHETase的晶体结构[58-60]，该酶的总体结构类似于阿魏酸酯酶，具有典型的催化三联体和氧阴离子孔，存在的MHETase-Lid结构域赋予其高度的底物特异性。Sagong等[59]研究发现，胞外产生的MHETase可以作为exo-PETase来水解合成的PET五聚体；经改造的突变体MHETaseR411K/S416A/F424I表现出更高的BHET水解活性，从而提高了对PET薄膜的降解效率。Knott等[60]则研究了PETase和MHETase在无定形PET上的高度协同关系，并构建出二者的嵌合蛋白用于实现PET的完全降解。这说明人工设计的双酶体系用于PET废物的解聚是一个有前途且富有成效的领域，值得继续研究。目前，在嗜热性角质酶方面，该体系的研究已取得了一定成果，例如，Barth等[61]建立的固定化双酶体系(TfCa-TfCut2和TfCa-LCC)能够在60 ℃下高效降解PET薄膜，固定化TfCa可以持续水解抑制性MHET，使得双酶协同作用的酶解产物总量分别增加91%和104%。Carniel 等[62]通过组合Candidaantarctica的脂肪酶CalB与HiC，可消除PET解聚产物MHET的积累，最终对PET 的降解效率较单酶催化系统提高了7.7倍。

综上，虽然PETase对PET有着高度的底物特异性，对酶分子的改造也取得了一定的进展(表2)。如果想真正实现工业化应用，还需要进一步对PETase的同源酶进行挖掘或者提高它的酶性能。

表2 PETase的同源酶及改造变体

3 展望

建立“塑料垃圾—解聚单体—高值化产品”的生物循环经济途径，不仅能推动相关产业发展，还能遏制原油的无节制消费和温室气体排放，减少塑料污染。为实现“降塑再造”这一目标，近年来国内外研究人员开展了各种废塑料降解微生物资源筛选和关键酶元件的挖掘改造工作，在PET 酶法解聚与催化机制方面取得了重要突破。然而，塑料解聚的酶元库仍存在催化效率低、稳定性差、表达量低等问题，这限制了塑料解聚酶的规模化生产与应用。利用计算重设计、定向改造等蛋白质工程技术，有望提高塑料解聚酶的活性、稳定性和特异性，为塑料污染的生物处理提供资源储备。虽然目前仅依靠生物技术手段还无法有效处理已存在的数十亿t的塑料垃圾，但随着国家政策的推进和个人生活方式的改变，塑料的回收将更加有效率，这为PET的生物降解与循环利用提供更好的机遇。