LED光质调控微藻生长及目标产物积累的研究进展

张 虎，朱瑞鸿，谭英南，邓 仟，周宏亮，高保燕 ，张成武

(1.暨南大学 生命科学技术学院 生态学系 水生生物研究中心，广东 广州 510632；2.甘肃德福生物科技有限公司，甘肃 定西 743000)

微藻细胞可以积累大量油脂、蛋白质、多糖、色素、不饱和脂肪酸、多酚和甾醇等物质，在能源、食品、饵料、化妆品、保健品及药品等行业有巨大的应用前景[1-3]。光不仅可以为光自养或混养生长的微藻提供能量[4]，而且还能作为信号分子调控细胞中关键代谢产物的生物合成[5-6]，对实现微藻的高效培养及目标产物的大量积累起着至关重要的作用。尽管以太阳光作为光源培养微藻可以降低生产成本，但是由于太阳光极易受季节、天气及昼夜周期等变化而发生剧烈改变，并不能完全满足微藻生长或代谢产物积累的需要，从而严重限制了微藻的产能[7]。与太阳光相比，人工光源可以更好地控制光照条件，增加了产业化生产微藻生物质及高附加值产品的可行性[8]，而且从实现这些物质高产的角度考虑，使用人工光源培养微藻的成本也可能更低[7,9]。

在常用的人工光源中，发光二极管(LED)经过60多年的发展，其发光效率已经远远高于荧光灯和高压钠灯等光源[10]。同时，LED不仅能够精准调控光照条件[7]，而且还具有体积小、使用寿命长、安全性高及发热量低等优点[11]。自20世纪八九十年代以来，已经有利用LED作为人工光源来培养微藻的研究报道[11]。此外，不同LED光质相对应的光谱可以设计在很窄的范围(甚至小于10 nm)内，这不仅能够提高微藻的光能利用效率[12]，而且还有利于高效光生物反应器的研发[13]。开发基于LED为光源的室内光生物反应器已经被认为是实现微藻培养从“靠天吃饭”的农业模式转变到“精准可控”的工业模式的有效手段之一[3]。这些优势使得LED在微藻培养及相关生物制品生产的研究中广受关注[11,14]。在LED光照的所有条件(光强、光质、光周期等)中，光质是影响微藻光合作用效率及生化组分变化的最重要因素之一[15-16]。目前，已经有研究[6,17-18]显示，适宜的LED光质条件不仅可以促进藻细胞快速生长，而且还有利于目标代谢产物大量积累。这为开发基于LED光质调控技术为基础的微藻高效培养新工艺提供了可能。为此，LED光质在微藻生产中具有重要的实际应用价值，极具发展潜力。

因此，本文从微藻可吸收利用的光谱范围及光受体、不同LED光质对微藻生长及关键产物积累的影响、基于LED光质调控实现微藻高效生产目标代谢产物的策略等方面进行阐述，同时还讨论了LED光质在今后微藻生产中的4个极具潜力的发展方向，以期为利用LED光质高效培养微藻、大量生产目标代谢产物提供参考，进而加速微藻产业的发展。

1 微藻可吸收利用的光谱范围及光受体

光是光自养生物生长及代谢的能量来源。常见的太阳光是一种复色光，它通过色散系统(如，光栅、棱镜)进行分光后，依照波长(或频率)的大小顺次排列形成的图案即是光谱。根据波长的大小，光谱主要分为紫外光谱(100～380 nm)、可见光谱(380～740 nm)及红外光谱(740～2 500 nm)等[19]。

1.1 微藻可吸收利用的光谱范围

微藻可吸收利用的光谱主要集中在可见光谱，可见光谱又可根据波长分为紫光(380～450 nm)、蓝光(450～485 nm)、青光(485～500 nm)、绿光(500～565 nm)、黄光(565～590 nm)、橙光(590～625 nm)和红光(625～740 nm)这7种不同的光质(光谱组成)(图1(a))。微藻细胞可以通过相应的光受体来对生长及代谢进行系统调控[5, 20-22]。

图1 可见光光谱(a)(改自Kim等[21])及不同光合色素的吸收峰(b)(改自Warren等[22])

微藻利用叶绿素及其他光合辅助色素(藻胆素、类胡萝卜素)进行光能的吸收及捕获。在长期的进化过程中，通过初级内共生(primary endosymbiosis)及二次内共生(secondary endosymbiosis)后，不同门类的微藻形成各自特有的光合色素及补光色素复合物(表1)[23-27]，它们对不同光谱的吸收存在较大差异(图1(b))，所以不同微藻可吸收利用的光谱范围也不相同。例如：蓝藻含有叶绿素a和藻胆蛋白(藻蓝蛋白(phycocyanin，吸收峰约为620 nm)或藻红蛋白(phycoerythrin，吸收峰约为550 nm))，因而可以大量吸收红光、黄光及绿光；一些蓝藻细胞中还含有叶绿素d或叶绿素f，其吸收光谱发生红移，能够吸收远红外光谱；但是细胞缺乏叶绿素b，进而对蓝光的吸收很少[26]。相反，绿藻由于缺乏藻胆蛋白而不能有效吸收利用黄光和绿光，但是细胞含有叶绿素b及多种类胡萝卜素，可以更为高效地利用蓝光[26]。红藻、灰胞藻和隐藻在进化过程中仍保留藻胆素，因此这些微藻吸收利用短波长光(蓝光、绿光和黄光)的能力也可能比绿藻更强[11, 24]。同时，一些藻类中还存在特殊的捕光色素复合蛋白，例如硅藻、褐藻、金藻和黄藻等就存在岩藻黄素-叶绿素a/c复合蛋白(fucoxanthin-chlorophyll a/c complex)，真眼点藻纲的微藻存在堇菜黄素-叶绿素a复合蛋白(violaxanthin-chlorophyll a complex)，它们可以增强细胞对蓝光与绿光的吸收[27]。此外，在相同门类的微藻中，同一光合色素的含量也会因种属、甚至株系的不同而存在较大差异[23]。同时，藻类的每一个叶绿素分子捕获红光或蓝光的光量子数与藻细胞的结构及叶绿体的构形也存在着较大关联性[11]。因此，对于某一特定藻株来说，其细胞可吸收的光谱范围及利用这些光的效率具有独特性。以LED为光源时，可将光质设定在该藻株生长及目标产物积累的最佳范围内，能够最大限度地满足这些藻株特有的光谱吸收及利用特性[11]。

表1 蓝藻及真核藻类中存在的光合色素类型及其吸收光谱特征[25, 27]

1.2 光受体(photoreceptor)

光受体通常由一个蛋白感光单元结合到另一个非蛋白生色团构成[5]，是细胞接收和转化光信号的桥梁，在调控细胞的各种生理过程中发挥着重要作用[28]。微藻中主要存在3种类型的光受体，即蓝光受体蛋白家族，包括隐花色素(cryptochrome，CRY)、向光素(phototropin，PHOTO)、金色素(aureochromes，AUREO)和光-氧-电-组氨酸激酶(LOV-HK))，视紫红质(rhodopsin，RHO)和光敏色素(phytochrome，PHYTO)[5,29-30]。

CRY是一类蓝光受体，它们在氨基酸序列及结构上和光修复酶高度相似，属于隐花色素/光修复酶家族(CPF)[5]。微藻中含有种类丰富的CPFs超类，包括动物型CRY/6-4光修复酶、植物型CRY、植物型相似CRY、DASHs(Drosophila，Arabidopsis，Synechococcus，Homo)型CRY及环丁烷嘧啶二聚体(CPD)光修复酶[31]。这些CPFs不仅可以增强微藻细胞对蓝光的吸收能力，而且还能够参与细胞分化、生物节律调节及捕光色素合成等重要生物过程[28, 32-33]，对微藻生长及相关代谢活动产生重要影响。

PHOTO、AUREO和LOV-HK同属于LOV蓝光受体蛋白家族。其中，PHOTO含有2个连续的LOV结构域，它们分别连接着N端感光结构域和C端丝氨酸/苏氨酸激酶结构域[34]。Li等[35]研究发现，PHOTO只分布于真核绿藻及高等植物中，因此它们很可能共起源于某种绿色植物。在莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中被发现，PHOTO参与调控细胞的有性生殖[36]、眼点发育及趋光性[37]、叶绿素及类胡萝卜素生物合成相关基因的丰度等[38]。AUREO含有的LOV结构域和碱性亮氨酶拉链蛋白(bZIP)结构域相连接。AUREO最初在无隔藻(Vaucheriafrigida)中被发现，而且只存在于能进行光合作用的异鞭藻类中[39]。Suetsugu等[40]和Huysman等[41]研究发现，AUREO参与调控无隔藻的性器官原基形成及藻细胞分枝、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)细胞分裂等。在LOV-HK中，LOV结构域C端含有组胺酸激酶(HK)，在多种真核藻类中都发现了LOV-HK，例如莱茵衣藻、三角褐指藻和微胞藻(Micromonassp.)等[42]。这种蓝光受体蛋白已经被证实参与调控细胞的黏附、致病及生物节律等[42-43]。总之，上述3种LOV蓝光受体蛋白不仅可以影响蓝光吸收，而且还能参与调控藻细胞中多种重要的生物过程。

在调出的3109份病历中，以《中国老年人潜在不适当用药目录》[3]为依据，对老年患者的用药潜在风险情况进行评价，共有2545份病历存在潜在不适当用药的风险，占81.9%。按药品类别和名称分类，涉及12类36种药物共计5516例次存在潜在不适当用药的风险（1份病历可能同时存在多种药物的潜在不适当用药的风险），其中占前四位的是呼吸系统用药、血液系统用药、内分泌系统用药和神经系统用药，见表2、表3。

RHO是一种光依赖型结合蛋白，由含有维生素A的视黄醛作为生色团，能够吸收波长为400～600 nm的光谱[29,44]。同时，RHO具有多种重要的生理功能，例如作为光依赖型离子泵、门控通道以及传感器等来调控细胞的光能转化及信号转导[5]。此外，在莱茵衣藻中还发现RHO可以充当紫外(UV-A)和蓝光的光控开关，在藻细胞应对不利光环境(例如UV-A)中也发挥重要作用[45]。

PHYTO是一类吸收红光-远红光可逆转换的光受体，已经在高等植物中被大量研究。微藻的PHYTO很可能和高等植物中的同源并具有相似的功能[46]，但是它的吸收光谱比高等植物中的更为宽泛，可从青绿藻(Prasinodermacoloniale)中蓝光转换光循环(photocycle)(吸收波长为586～690 nm)变化到伪矮海链藻(Thalassiosirapseudonana)中的红光转换光循环(吸收波长为686～764 nm)[47-48]，这可能为微藻更好地利用光能提供帮助。

2 不同LED光质对微藻生长及目标产物积累的影响

在常见的7种LED单色光质及LED白光中，尽管叶绿素的吸收峰主要集中在红光和蓝光波段[49]，但是光合生物已经进化出一系列的捕光色素，能够吸收可见光中所有的光质[50]。因此，微藻对另外5种单色光质也有一定程度的吸收。同时，不同LED光质也可以对微藻中目标产物的积累产生重要影响。

2.1 红光

红光是影响多数微藻生长或代谢的最重要光质[22]。Markou等[51]研究发现，LED红光可以提高钝顶节旋藻(Arthrospiraplatensis)(原名钝顶螺旋藻Spirulinaplatensis)的生长，其生物质产率是蓝光条件下的6.56倍，但是红光并不能促进叶绿素a和藻蓝蛋白的积累。同样，在布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)中也发现，红光可以促进细胞生长，其比生长速率是蓝光条件下的1.27倍，但是红光对油脂及烷烃的积累没有促进作用[52]。相反，在蓝藻Cyanobiumsp.中发现，红光不能有效促进细胞生长，但是可以显著提高细胞的色素含量及抗氧化能力[53]。在斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)和微拟球藻(Nannochloropsisoceanica)中也发现类似的现象，即红光可以提高细胞的抗氧化能力[54]。此外，对于某些微藻来说，红光既可以促进微藻生长，又可以提高细胞积累目标产物的能力。Zhang等[55]研究发现：红光可以显著促进长耳齿状藻(Odontellaaurita)的生长，其最高生物质浓度分别是白光和蓝光条件下的1.37和1.13倍；同时，红光还可以促进细胞积累岩藻黄素，其最高岩藻黄素含量分别比白光和蓝光条件下提高16.1%和4.3%。Li等[56]发现，红光可以同时促进盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)的生长及总类胡萝卜素积累，其最高细胞数和总类胡萝卜素含量分别比白光条件下提高了23%和7.3%。Hurtado等[57]发现，红光可以同时促进斜生尖带藻(Acutodesmusobliquus)高度积累生物质和油脂。Zhang等[6]研究发现：红光可以同时促进拟波吕斐摩斯真眼点藻(Eustigmatoscf.polyphem)积累生物质和油脂；进一步研究还发现，藻细胞在红光培养时，上调了光合作用、中心碳代谢、脂肪酸生物合成等多种代谢通路的关键基因，从而可以促进细胞快速生长和油脂大量积累。

2.2 蓝光

蓝光由于波长短、能量高，在多数研究中通常作为刺激因子来提高微藻的生物质浓度或目标产物含量。对微拟球藻为模型的研究中发现，蓝光可以显著促进细胞生长，获得的生物质浓度比其他光质条件下的结果提高了17%～750%[16, 49, 58-59]。此外，在对小球藻[60]、栅藻[61]、三角褐指藻[62]和巴夫藻(Pavlovalutheri)[21]的研究中也发现，蓝光能促进细胞的生长。同时，蓝光也是促进微藻细胞积累关键产物的有效刺激因子。以生产油脂为例，蓝光可以促进小球藻[63]、微拟球藻[48]和雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)[64]等微藻积累油脂。此外，蓝光还可以促进小球藻[60]、盐生杜氏藻[56]和拟波吕斐摩斯真眼点藻[6]积累类胡萝卜素，也有利于节旋藻[65]和雨生红球藻[66]分别积累藻蓝蛋白和虾青素。

2.3 绿光

通常绿藻门的藻类对绿光的吸收较少，但是绿光同样可以有效调控多种微藻的生长及目标产物积累量。Mohsenpour等[67]发现，绿光可将蓝藻Gloeothecemembranacea的叶绿素a含量提高12.8%。Latsos等[68]和Kim等[21]分别发现，绿光可以促进红胞藻(Rhodomonassp.)和紫球藻(Porphyridiumcruentum)生长。有趣的是，绿光同样也可以促进某些绿藻生长。Lee等[69]发现，绿藻Ettliasp.YC001在高光强绿光条件下培养获得的生物质浓度比相同条件下红光或蓝光培养获得的结果提高37%以上。此外，绿光也可以促进某些微藻积累油脂。Jung等[62]发现，绿光有助于三角褐指藻积累油脂，最高可达干重的60.6%。Ra等[58]发现，绿光可以促进微拟球藻积累油脂。Kim等[21]研究发现，绿光培养可以提高普通小球藻的油脂含量。这些结果为采用LED绿光作为补充光来培养微藻高效生产目标产物提供了依据。

2.4 黄光

除了上述4种单色光质之外，其余3种LED单色光在微藻培养中的研究仍较少。此外，LED白光[53, 72]、红橙光(red-orange light)[73]、远红光(far-red light)[74-75]对多种微藻的生长及代谢也产生重要影响。鉴于不同LED光质在调控微藻生长及目标产物积累方面的作用，有必要全面、系统地开展不同LED光质对微藻生理生化、分子、甚至基因水平影响的研究，从而为利用LED光质高效培养微藻提供理论依据，更好地将此种培养技术应用于实际生产。

现将不同LED光质对微藻生长及目标产物积累的影响总结于表2。

表2 不同LED光质对微藻生长及目标产物积累的影响

3 基于LED光质调控技术实现微藻高效生产目标产物的策略

尽管LED光质可以调控微藻的生长及目标产物积累量，但是要想实现目标产物的低成本、高效生产，仍需要以LED光质调控技术为基础，开发满足实际生产的培养策略。目前，已经发展出分阶段LED光质转换培养模式、LED闪光(flashing light)培养模式，同时，也已经开发出LED光质精准可控的新型高效光生物反应器。

3.1 分阶段LED光质转换培养模式

多数微藻在生长及目标产物积累阶段所需的最佳LED光质并不相同，而且单一光质也并不能满足某些微藻的生长及代谢之需。为此，采用光质转换的策略，分别在生长和目标产物积累阶段通过不同的光质或光质组合来培养微藻，使微藻在各个阶段都处于最佳的光质条件下来高效生产目标产物。目前，这种策略已经用于培养多株微藻来高效生产目标产物[77-83](表3)。

表3 不同微藻在LED光质转换策略中其生长及目标产物积累阶段所需的光质比较

3.2 LED闪光(flashing light)培养模式

在微藻培养时会由于细胞密度的不断增大及光在液体中的衰减而导致光不足，所以LED闪光培养模式通过增加光照强度，使光的透过性增强，同时每隔固定时间(几毫秒、秒或分钟不等)停止光照，使细胞免受光抑制或在光抑制后有充足时间进行修复[84]，这样可以使微藻接收到的光量子数和连续光照条件下的相同(图2)。这种培养策略不仅可以为高密度培养的细胞提供充足光能，而且间断光照也有利于节约电能、降低生产成本。Xue等[85]发现，在钝顶节旋藻培养中，采用LED白光进行闪光培养时获得的生物质浓度显著高于连续光照下的结果。Katsuda等[86]在雨生红球藻生产虾青素的研究中发现，采用LED蓝光进行闪光培养时可以同时促进细胞生长及虾青素积累。Yustinadiar等[59]在微拟球藻中也同样发现LED蓝光闪光培养可以提高生物质浓度。这些结果为采用多种LED光质对微藻进行闪光培养以便实现目标产物的高效生产提供了参考。

图2 藻液经通气充分混合时LED闪光培养模式对微藻细胞的影响

3.3 LED光质精准可控的新型高效光生物反应器(PBR)开发

光生物反应器是培养微藻的关键设备，决定着微藻资源开发的成败[87]。由于微藻对不同光质的吸收及利用效率具有独特性，在系统研究各种光质对微藻生长及目标产物积累的影响之后，根据微藻各个生长时期及产物积累阶段对不同光质的需求，基于LED光质调控技术，可以研发更为高效的光生物反应器。这些反应器可以将微藻培养所需的光能从室外太阳光(图3(a))、室内荧光灯(图3(b))及LED单色蓝光(图3(c))转变到精准可控的LED光质(图3(d))。同时，这种转变可以促进微藻的生长及目标产物积累。如，Borowiak等[88]采用新型、全自动、半工业化组合式PBR可以精准控制雨生红球藻生长及虾青素积累所需的LED红光、蓝光及白光的比例，实现了虾青素的高效生产。

(a)室外太阳光下利用跑道池式PBR培养微藻；(b)室内白炽灯下利用柱式PBR培养微藻；(c)室内LED单色蓝光下利用柱式PBR培养微藻；(d)室内LED可控光质比例下利用新型、全自动、内置光源PBR培养微藻

4 LED光质调控技术在今后微藻生产中的应用

现阶段，LED光质调控在微藻培养中的优势已经引起了诸多研究者及微藻企业的高度重视。同时，已经有基于LED光质调控技术实现雨生红球藻[88]和长耳齿状藻[55]分别高效生产虾青素以及岩藻黄素的中试生产。但是在实际生产中，这种培养技术仍然面临较高生产成本的挑战[7]。为了更为低成本、高效地利用LED光质调控技术来促进微藻大量生产生物制品，结合文献报道，笔者认为今后LED光质调控技术应该在以下4个方向重点发展。

4.1 新型光电材料促进LED升级换代，从而提高电—光及光—生物质的转化效率，实现微藻经济高效生产

目前，LED作为人工光源培养微藻仍存在生产成本高、发热量大、需额外控温等弊端。因此必须开发新型高效LED，以提高电能转化为光能的效率，降低热损耗，进一步提高光能转化为生物质的效率，这样才能最终实现微藻的经济、高效生产。新型光电材料能够促进LED升级换代，为提高LED电—光及光—生物质的转化效率提供机会。如，Kang等[89]利用稀土材料开发了一种新型LED，该LED可以显著提高电能转化为红光和蓝光的效率，在降低热损耗的同时，也能促进小球藻生长，从而提高光能转化为生物质的效率。随着LED技术的不断发展，更多先进光电材料将会用于LED的开发，促进LED升级换代，提高电—光及光—生物质的转化效率，最终为基于LED实现微藻的经济高效生产提供可能。

4.2 基于LED光质调控技术实现微藻高效培养，助力“碳中和”

生物固碳是实现“碳中和”的有效途径之一，微藻超高的光合作用能力使其能够高效固定CO2。李珂等[90]研究发现，适宜的LED光质可以显著提高微藻的光合作用效率，进而提高对CO2的固定率。Kumar 等[91]研究发现，Micractiniumpusillum和Ourococcusmultisporus在红光培养时可将CO2固定效率提高50%以上。而Yan等[92]发现，当红光和蓝光的比例为5∶5时，小球藻固定CO2的效率会进一步提高。因此，采用LED光质调控技术来提高微藻对CO2的固定效率，实现CO2的高效生物固定，在加快“碳中和”进程上大有可为，是一种值得深入研究及工业化应用的CO2高效固定策略。

4.3 新型内置LED光源PBR的开发，助力微藻“工业化”生产

内置LED光源可以降低光衰减带来的不利影响，进而能够提高光能利用效率，促进微藻生长，具有工业化应用潜能[93]。最近，笔者所在课题组的Zhang等[55]利用内置可变光谱(红光和蓝光)LED灯的PBR为装置来培养长耳齿状藻生产岩藻黄素，在20 L的PBR中获得的岩藻黄素产率可达9.41 mg/(L·d)，是目前微藻光自养生产岩藻黄素的最高水平；进一步放大体积(240 L)后的岩藻黄素产率仍可达3.73 mg/(L·d)，证明这种新型内置LED光源的PBR培养微藻在生产目标产物方面具有高效性。这也为下一步基于LED光质调控技术为基础来开发更为高效的内置光源PBR奠定了基础。

此外，由于自动化技术的不断进步，在线控制温度、pH、通气量及溶解氧等重要指标早已经在微藻培养中实现。为此，集LED光质调控技术与自动化技术为一体的新型内置LED光源PBR有望实现微藻培养过程中所有重要影响因子的在线自动化精准控制，从而真正实现微藻培养从“设施农业”向“工业生产”转变。

4.4 不同LED光质作为信号分子促进微藻异养或混养生长时光依赖型产物的高效生产

微藻异养或混养时具有高效生产生物质的优势，然而这些培养模式尤其是异养时并不能促进微藻高效积累某些光依赖型产物[94-95]。为此，采用LED为光源来促进这些产物的大量积累成为解决上述问题的一个较好方法。Wang等[96-97]在发酵罐内部补充LED白光，实现蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)生物质、蛋白质、色素及油脂的高效生产。微藻在异养或混养高密度培养时，细胞相互遮挡严重，因此光并不能提供能量，而是主要作为信号分子来调节细胞生长和代谢。为此，利用不同LED光质作为信号分子来参与调控微藻异养或混养生长，可以充分发挥异养或混养模式生产微藻生物质的高效性及LED光质诱导藻细胞积累目标产物的独特性。

5 结论

LED光质可以调控微藻生长及目标产物积累，已经在多株微藻中进行了深入研究。目前的研究主要集中在微藻可吸收利用的光谱范围及光受体、不同LED光质对微藻生长及目标产物积累的影响、基于LED光质调控技术实现微藻高效生产目标产物的策略等。尽管LED光质调控技术在微藻培养中具有巨大应用前景，但是这种技术仍处于初级发展阶段，面临较高生产成本的挑战。今后可以从新型光电材料促进LED升级换代、进而提高电—光及光—生物质的转化效率实现微藻经济高效生产，基于LED光质调控技术实现微藻高效培养助力“碳中和”，新型内置LED光源PBR开发助力微藻“工业化”生产以及不同LED光质作为信号分子促进微藻异养或混养生长时光依赖型产物的高效生产这4个方面加强研究，从而实现微藻源相关生物制品的经济高效生产，加速微藻产业的发展。