沙门菌外膜蛋白相关基因缺失株的致病性

段世宇, 杨 阳, 令狐远凤, 杨 琦,3, 周碧君,3

(1.贵州大学动物科学学院；2.贵州省动物疫病研究室；3.贵州省动物疫病与 兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)

近年来，鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)的致病率呈上升趋势[1]，每年造成数百万人感染和死亡.沙门菌主要感染肠道，症状表现为呕吐、腹泻、高烧等，重症者出现死亡.

外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)是革兰氏阴性细菌外膜(outer membrane, OM)的主要蛋白质成分,该类蛋白质在调控细胞结构和形态、营养获取、定殖和入侵以及防止抗生素等外部威胁方面发挥着关键作用[2].Heffernan et al[3]研究发现，Rck基因座与革兰氏阴性菌中表达的外膜蛋白家族同源，其中2种与毒力表型相关：PagC，能提高鼠伤寒沙门菌在巨噬细胞中的存活率和毒力；Ail，是一种耶尔森氏菌染色体的产物，能够介导细菌黏附和侵入上皮细胞系.Xu et al[4]发现，OMP的表达有助于幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)在感染初级阶段附着在胃上皮细胞上，并能增加该菌的毒力.一些来自不同革兰氏阴性细菌的OMP已被确认为宿主免疫识别的重要因素，可参与细菌多种生命活动，具有开发为疫苗的潜力[5].

小RNA(small RNA, sRNA)是一类可对mRNA进行调控的重要因子，参与细菌多种生命过程，如调节毒力、适应环境变化、调节OMP基因的表达等；同时，sRNA对mRNA的调节作用往往需要伴侣蛋白Hfq参与.Hfq在细菌生理功能调节中发挥着多种作用[6]：除了协同sRNA共同作用外，还能够单独调节细菌多种基因的表达，对细菌生长、毒力、侵袭力等有影响.Sittka et al[7]研究表明, Hfq参与兼性细胞内病原体鼠伤寒沙门菌毒力因子的表达和分泌.sRNA和Hfq可对大量的mRNA和蛋白进行调控，进而影响细菌的致病性[8].

FadL、OmpN、YbfM在沙门菌中均参与外膜蛋白的合成、转运、识别等过程，Hfq及sRNA RybB也被确定能对以上3个OMP基因产生一定的调控作用[9-10].但外膜蛋白FadL、OmpN、YbfM及伴侣蛋白Hfq和sRNA RybB对沙门菌致病性的影响并未完全明确.本试验利用实验室前期构建的鼠伤寒沙门菌基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB& Δhfq研究其对该菌致病性的影响，旨在为了解这些基因对沙门菌致病性的作用机制提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试菌株

表1 缺失菌株基因型Table 1 Genotypes of deletion strains

鼠伤寒沙门菌标准菌株LT2由法国国家科学研究中心(CNRS)分子遗传学Bossi实验室惠赠；鼠伤寒沙门菌缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB& Δhfq均由贵州省动物疫病研究室构建.缺失菌株基因型如表1所示.

1.2 供试动物

无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级KM系雄性小鼠，18～22 g，4～6周龄，购自辽宁长生生物技术股份有限公司.在特定的无病原体条件下养殖小鼠，提供充足的食物和水.试验已通过贵州大学动物伦理和福利委员会批准(编号：EAE-GZU-2021-E005).

1.3 鼠伤寒沙门菌生长曲线的测定

将鼠伤寒沙门菌标准菌株LT2及基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB& Δhfq分别接种于LB平板中复苏培养，挑取平板上单个菌落接种于液体LB中，37 ℃摇床中培养过夜.次日，通过紫外分光光度计(Q-5000)调整菌株的D600 nm=0.1，按照1∶100的比例取500 μL菌液接种于50 mL液体LB中，37 ℃、170 r·min-1振荡培养，每隔 1 h取1 mL细菌悬浮液，通过紫外分光光度计测D600 nm值.统计结果，并制作生长曲线图[11].

1.4 鼠伤寒沙门菌的毒力测定

将鼠伤寒沙门菌标准菌株LT2及基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB& Δhfq分别接种于5 mL液体LB中，37 ℃摇床中培养过夜.次日，取100 μL菌液至新的LB试管中，培养10 h，将菌液12 000 r·min-1离心5 min，弃掉上清液，通过无菌PBS重悬浮洗涤，调整菌液浓度至1×109CFU·mL-1，再梯度稀释为1×108、1×107、1×106、1×105CFU·mL-1.将小鼠随机分组，每组5只，腹腔注射菌液0.5 mL·只-1，以注射相同剂量PBS为空白组.连续15 d观察、记录小鼠死亡数，通过改良寇式法[12]计算各菌株对应的LD50.

1.5 小鼠肝、脾定殖能力测定

将鼠伤寒沙门菌标准菌株LT2及基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB& Δhfq菌液浓度调整为1×108CFU·mL-1，制备方法同1.4.将小鼠随机分组，每组5只，腹腔注射菌液0.5 mL·只-1，分别在6和48 h后取小鼠肝脏和脾脏称重，计算肝脏、脾脏指数[13].匀浆后使用无菌PBS稀释，取100 μL稀释液进行10和100倍稀释涂板，重复3次，置于37 ℃温箱中过夜培养，菌落计数，计算相应组织的载菌量[14].

1.6 数据处理

数据以平均值±标准偏差表示，通过GraphPad Prism 8.0.2软件分析数据和制图.

2 结果与分析

2.1 鼠伤寒沙门菌株生长曲线

由图1可以看出：鼠伤寒沙门菌标准菌株LT2及基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq在液体LB中有相似的生长曲线；虽然ΔrybB和ΔrybB& Δhfq生长速度相较于标准菌株有所减缓，但是变化不显著.

图1 鼠伤寒沙门菌LT2及基因缺失菌株生长曲线Fig.1 Growth curve of S.typhimurium LT2 and gene deletion strains

2.2 鼠伤寒沙门菌株的毒力

结果显示：鼠伤寒沙门菌标准菌株LT2对小鼠的LD50为3.97×107CFU；基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM对小鼠的LD50分别为1.58×105、6.29×105、9.97×105CFU,与LT2相比毒力明显增强；基因缺失菌株Δhfq和ΔrybB& Δhfq对小鼠的致死率未高于50%；而基因缺失菌株ΔrybB对小鼠的LD50为9.97×107CFU，与LT2相比毒力有所下降(表2).

表2 鼠伤寒沙门菌株对小鼠的LD501)Table 2 LD50 of S.typhimurum strain to mice

2.3 基因缺失菌株在脾脏上的定殖能力

图2显示：小鼠腹腔注射各菌株6 h后，相对于LT2, Δhfq、ΔrybB、ΔfadL、ΔybfM处理组的脾脏指数极显著上升(P<0.01)；ΔrybB& Δhfq处理组的脾脏指数显著上升(P<0.05)；而ΔompN处理组的脾脏指数低于LT2，但差异不显著(P>0.05).图3显示：相对于LT2，小鼠注射Δhfq6 h后脾脏上的载菌量显著降低(P<0.05)；注射其余菌株后的脾脏载菌量与LT2差异不显著(P>0.05).

小鼠注射各菌株48 h后，相对于LT2，各处理组的脾脏指数极显著升高(P<0.01)(图2).相较于LT2，注射ΔrybB& Δhfq和Δhfq48 h后脾脏上的载菌量显著降低(P<0.05)；注射其余菌株后脾脏上的载菌量与LT2差异不显著(P>0.05)(图3).

“**”代表差异极显著(P<0.01)；“*”代表差异显著(P<0.05)； “ns”代表差异不显著(P>0.05).图2 小鼠注射各菌株后的脾脏指数Fig.2 Spleen index of mice after injected with different strains

2.4 基因缺失菌株在肝脏上的定殖能力

图4显示：小鼠腹腔注射各菌株6 h后，相对于LT2，Δhfq、ΔrybB& Δhfq、ΔompN处理组的肝脏指数极显著下降(P<0.01)；ΔybfM处理组的肝脏指数显著下降(P<0.05)；而ΔrybB和ΔfadL处理组的肝脏指数变化不显著(P>0.05).图5显示：相对于LT2，小鼠注射Δhfq和ΔrybB& Δhfq6 h后的肝脏载菌量显著降低(P<0.05)；而ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、ΔrybB处理组的肝脏载菌量无显著变化(P>0.05).

“**”代表差异极显著(P<0.01)；“*”代表差异显著(P<0.05)； “ns”代表差异不显著(P>0.05).图4 小鼠注射各菌株后的肝脏指数Fig.4 Liver index of mice after injected with different strains

小鼠注射各菌株48 h后，相对于LT2，ΔrybB、ΔfadL、ΔybfM处理组的肝脏指数极显著下降(P<0.01)；ΔrybB& Δhfq处理组的肝脏指数显著下降(P<0.05)；而Δhfq和ΔompN处理组的肝脏指数变化不显著(P>0.05)(图4).相对于LT2，注射ΔrybB和ΔfadL48 h后肝脏载菌量变化不显著(P>0.05)；而Δhfq和ΔrybB& Δhfq处理组的肝脏载菌量显著下降(P<0.05)；ΔompN和ΔybfM处理组的肝脏载菌量显著上升(P<0.05).

3 讨论

本研究结果显示，相较于鼠伤寒沙门菌标准菌株LT2,伴侣蛋白Hfq及外膜蛋白OmpN、YbfM、FadL基因缺失菌株生长速度无变化，而rybB和rybB&hfq基因缺失菌株生长速度有所下降，但变化不显著.这说明hfq、ompN、ybfM、fadL、rybB基因对鼠伤寒沙门菌生长的影响并不大.

伴侣蛋白Hfq可调节多种细菌的毒力：hfq基因缺失会抑制大肠杆菌(Escherichiacoli)生物膜形成，降低细菌的运动性与趋化性[15]；Hfq参与李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的毒力作用及其生物膜的形成，hfq基因缺失会显著降低该菌的毒性[16]；hfq基因缺失也可降低志贺杆菌(Shigella)的毒力[17-18]；hfq基因缺失可使维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)对罗非鱼鱼苗的毒力降低20倍[19]；在模型病原体鼠伤寒沙门菌中，hfq基因缺失会降低该菌感染小鼠、侵入上皮细胞、分泌毒性因素和在巨噬细胞内生存的能力[20].本研究结果表明：hfq基因缺失株对小鼠的毒力降低；小鼠腹腔注射该基因缺失菌株后，肝脏和脾脏组织中的载菌量降低.这说明hfq基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌的致病性.

有研究认为，sRNA RybB的主要功能是抑制OMP的生物合成，这种sRNA受σE的调节，σE控制细胞生成中相关基因的表达，以响应OMPs和脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)成分的变化[21].Bearson et al[22]通过敲除omrA、omrB、rybB、micA、invR及rfaH等构建了沙门菌疫苗BBS 866.本研究结果显示：rybB基因缺失菌株对小鼠的毒力轻微降低；小鼠腹腔注射该基因缺失菌株后，肝脏和脾脏组织中的载菌量轻微降低.这说明rybB对鼠伤寒沙门菌毒力具备一定调控作用，但调控能力没有hfq基因强.而rybB和hfq同时缺失所产生的毒力与hfq缺失所产生的毒力相似，推测当hfq基因缺失时，与hfq相关的sRNA对细菌的作用会减弱甚至消失.

病原菌表面的外膜蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护作用，常被作为潜在蛋白疫苗进行研究.ompN合成的孔蛋白OmpN属于1型普通孔蛋白[23]，具有高度免疫性和保护性[24]，即使在鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)与沙门菌中也存在这样的免疫原性[25-26].该蛋白在物质跨膜运输过程中发挥重要作用，可增强细菌对相关药物如卡那霉素、四环霉素[27-28]等的敏感性，提高肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)的致病性[24].FadL蛋白质家族负责将疏水化合物输送到细菌外膜[29]，促使长链脂肪酸与高分子质量脂肪酸结合并允许这些化合物穿过外膜[24]；还可抑制FadR毒性的表达[30]，参与沙门菌致病岛(SPI-1)的Ⅲ型分泌系统(T3SS)，当沙门菌fadL基因缺失后，毒力显著增强[31].YbfM是一种假定外膜壳二糖蛋白,参与细胞外化合物(包括抗生素)的吸收，与多种耐药表型有关[32].本研究结果表明：ompN、ybfM、fadL基因缺失可导致鼠伤寒沙门菌的毒力出现不同程度上升；小鼠腹腔注射这些基因缺失菌株后，肝脏和脾脏的载菌量与标准菌株LT2差异不显著.

综上所述，伴侣蛋白Hfq、sRNA RybB缺失可降低鼠伤寒沙门菌的致病性，因此，可将其作为鼠伤寒沙门菌的减毒疫苗进行深入研究.ompN、ybfM、fadL基因缺失导致鼠伤寒沙门菌致病性增强，这些外膜蛋白影响沙门菌致病性的机制还有待进一步探究.