急性ST段抬高型心肌梗死患者血清MiRNA-146a水平与心肌损伤程度的相关性

吴 奇，肖圣珏，刘巧志，潘德锋

急性心肌梗死(acute myocardial infarction， AMI)是全球最常见的心脏事件，在心血管疾病中，它是对人类健康的最主要威胁[1]。AMI通常是冠脉不稳定斑块破裂、糜烂基础上继发血栓形成导致冠状动脉血管持续、完全闭塞[2]。据报道[3-5]，炎症物质和免疫细胞在斑块不稳定和斑块破裂过程中都发挥了重要作用，导致粥样斑块不稳定的重要因素[6-8]包括调节血管内炎症反应及新生血管的生成。因此，炎性因子是AMI发病的主要原因之一，是目前防治重点。

微小RNA(miRNA)是含有大约20～24个核苷酸的RNA，可以负向调节基因[9]。研究表明，miRNA 参与多种生物学功能，包括细胞增殖、凋亡和炎症，并与疾病机制，尤其是心血管疾病的机制表现出很强的相关性[10]。miRNA-146最早被证实与炎症因子有关，miRNA-146通过介导其下游基因参与免疫、炎症及肿瘤等的病理生理过程[11-12]。miRNA-146家族中包括miRNA-146a和miRNA-146b，研究[13]发现，动脉粥样硬化斑块中miRNA-146a的表达显著升高，并认为其沉积是动脉粥样硬化的原因。另有研究[14]发现，miRNA-146a在急性冠状动脉综合征患者的外周血单核细胞中表达上调，这些数据表明miRNA-146a表达增加可能会促进冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary artery disease， CAD)的发生和发展。miRNA-146a靶基因位点rs2910164C→G错配的变化，影响了成熟miRNA-146a的表达[15]。目前研究[16]认为，与GG纯合子相比，携带CG+CC基因型的人群罹患冠心病的风险增加，研究[17]认为这可能与通过改变miRNA-146a的表达水平高低有关。携带rs2910164 位点GC或CC基因型的个体与GG基因型携带者相比表达了更高水平的miRNA-146a。因此，miRNA-146a的基因型和表达水平均促进了冠心病的发生和发展。

已有研究关于miRNA-146a基因多态性的探索，主要集中在炎症、免疫、脑血管疾病、肿瘤等病理生理过程，较少研究miRNA-146a基因多态性与STEMI患者心肌损伤程度之间的关系。因此，本研究通过在人群中进行基因分型，再关联分析，探讨其与STEMI的发生及病情严重程度的关系，进一步了解miRNA-146a基因多态性的潜在功能效应。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年6月至12月于徐州医科大学附属医院心内科就诊92例确诊为急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardid infraction, STEMI)的患者为STEMI组。选择同期经冠状动脉CT血管造影术(CTA)或冠状动脉造影检查，以冠脉狭窄程度≤30%为标准筛选出的志愿者100例为正常对照组。

1.2入选及排除标准 入选标准[18]：①具有显著胸痛、胸闷等心肌缺血的临床症状，发作时间超过30 min以上且服用硝酸甘油不能完全缓解；②心电图显示：至少2个连续的胸前导联或至少2个相邻的肢体导联ST段抬高0.1 mV，或新发(可能新发)的左束支传导阻滞，有心肌缺血的动态演变过程；③心肌酶升高超过参考值上限99百分位值并有动态演变；④冠状动脉造影结果证实靶血管狭窄。排除标准：①先天性心脏病(室间隔缺损、房间隔及法洛四联症等)；②风湿性心脏病(二尖瓣、三尖瓣、主动脉瓣中有一个或几个瓣膜狭窄和(或)关闭不全)；③病毒性心肌炎；④外周血管疾病(动脉硬化性闭塞症、动静脉血栓形成及动脉瘤等)；⑤慢性阻塞性肺疾病及呼吸衰竭；⑥严重的肝肾功能不全；⑦血液系统疾病；⑧近期有感染或外伤史；⑨肿瘤。本研究经过医学伦理委员会通过并且征得患者及家属同意(伦理委员会受理号：XYFYLW2017-002)。

1.3临床资料收集 收集患者的年龄、性别、体重指数(BMI)、吸烟史、高血压史及糖尿病史等一般资料；记录入院即刻白细胞计数(WBC)、C反应蛋白(CRP)、脑钠肽(BNP)及心肌肌钙蛋白T(cTnT)等指标。

1.4样本采集及处理方法

收集入选患者入院后的血样标本送检血常规及常规生化等，另抽取4 ml静脉血样，分别装入2支抗凝管中。吸取1 mL全血血浆加入1 mL红细胞裂解剂混匀5 min后，12 000 r/min 离心1 min，弃上清液，再加入1 mL TRIzol RNA提取剂使沉淀重悬，保存于-80 ℃用于miRNA的提取，检测miRNA-146a的表达量。另一管血样保存于-20 ℃用于DNA的提取，检测 rs2910164的基因型。

RNA提取及实时定量聚合酶链式反应：应用RnaExTM Total RNA Isolation Solution提取总RNA，取1 μg总RNA应用MMLV反转录酶反转录合成cDNA,将各样品的miRNA146a和内参5S分别进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。并一式三份进行。针对U6 snRNA启动(Exiqon)的表达归一化之后，mRNA和miRNA的倍数变化计算采用 2-△△C法进行分析。

2 结果

2.1一般资料 STEMI组糖尿病、高血压、吸烟史及WBC明显高于正常对照组，高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白A(apoA)低于正常对照组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。两组年龄、低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、载脂蛋白(apoB)、脂蛋白LP(a)、BMI差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 STEMI组和正常对照组的一般资料比较

2.2血液中miRNA-146a基因型分布 miRNA-146a基因型在两组患者中分布存在差异，92例STEMI患者中CC基因型为45例(48.9%)，GC基因型为37例(40.2%)，GG基因型为10例(10.9%)。而对照组CC、GC、GG基因型分别为20例(20%)、52例(52%)、28例(28%)。相比于GG基因型，GC及CC基因型在STEMI患者中明显占有更高的比例(P<0.05)。将基因组合比较，与正常对照组相比，基因型GC+CC在急性STEMI患者中表现出更高的频数(P=0.004)。

表2 STEMI组和正常对照组的miRNA-146a rs2910164基因型分布[n(%)]

2.3血液中miRNA-146a表达水平差异 两组miRNA-146a表达水平存在差异，STEMI组表达是正常对照组的1.5倍(P<0.001)。见图1。

注：miRNA为血清微小RNA；STEMI为急性ST段抬高型心肌梗死；*P<0.001图1 STEMI组和正常对照组血浆miRNA-146a表达水平的差异

2.4miRNA-146a表达水平与STEMI患者CRP、WBC、BNP、cTnT及LVEF的相关性分析 STEMI患者miRNA-146a表达水平与CRP、WBC、BNP、cTnT及TG呈正相关(P<0.05),在校正了性别、年龄、高血压、糖尿病及吸烟等因素后，这种相关性依然存在。miRNA-146a表达水平每增加1个单位，白细胞计数增加0.306×109/L，CRP增加6.259 mg/L。STEMI患者miRNA-146a表达水平与心肌损伤程度呈正相关，miRNA-146a水平每升高1个单位，cTnT增加608.34 pg/L，BNP增加1047.26 pg/mL。此外，STEMI患者血液miRNA-146a表达水平与LVEF呈负相关。见表3。

表3 STEMI组miRNA-146a表达水平与cTnT、CRP、WBC、BNP、LVEF的相关性

3 讨论

本研究发现miRNA-146a基因型与罹患STEMI风险增加有关，CC、CG、GG基因型在两组人群中有差异，基因型CG+CC与GG组间差异有统计学意义。这些数据表明miRNA-146a rs2910164位点基因多态性可能与STEMI风险相关，即携带GG+CC基因型的人群较GG携带人群患STEMI的风险增高。研究认为[19-20]患者血浆中miRNAs水平增高的可能机制是心肌梗死后缺血坏死或梗死组织周边处于缺血状态下的存活心肌细胞可释放miRNAs。另外，miRNA-146a作为重要的负性调节因子参与了Toll样受体通路(TLRs)[21-23]，血液miRNA-146a表达水平经TLR2/TLR5的配体及IL-1β受体相关激酶刺激后可上调。因此，miRNA-146a表达水平升高可能是多种机制相互作用的结果。本研究中STEMI患者与正常对照组miRNA-146a表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示，miRNA-146a高表达水平可能倾向导致罹患STEMI的风险增加。

cTnT是心肌损伤坏死的标志物，在AMI的诊断、治疗及评估预后过程中有重要的临床价值，可作为评估心肌损伤严重程度的重要指标。心力衰竭时，心室壁张力增加，BNP作为心衰诊断、临床事件评估的重要指标，其增高的程度与心衰的严重程度呈正相关，心衰时分泌明显增加。本研究在分析miRNA-146a表达水平与基线资料相关性时观察到，STEMI患者组中miRNA-146a表达水平与cTnT、BNP呈正相关，在校正了性别、年龄、高血压、糖尿病、吸烟等因素后，这种相关性依然存在。这些结果表明miRNA-146a表达水平与心肌损伤程度呈正相关，可作为评估心肌损伤严重程度和预后的重要指标。

炎症反应是STEMI重要的发病机制之一，炎症可诱发免疫细胞浸润，血小板活化和粘连，参与整个病理过程，最终导致斑块破裂和STEMI发作。miRNA-146a是一个典型的多功能基因，通过介导其下游基因参与免疫、炎症、冠状动脉粥样硬化等多种病理生理过程。研究证实，miRNA-146a在T细胞、B细胞、单核细胞中均有表达，T细胞、B细胞、单核细胞等在动脉粥样硬化病理过程中发挥重要作用，并与多种炎症因子的活性有密切的关系。这可能与miRNA-146a主要靶向白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK-1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF-6)，作为重要的负性调节因子参与了TOLL样受体通路(TLRs)有关。在刺激TLRs通路后，髓样分化因子88(MyD88)依赖性信号转导途径最终激活核因子κB(NF-κB)，NF-κB可与多种靶基因的启动子结合，启动相关靶基因的转录激活，调节免疫反应中致炎因子的表达。此外，血浆miRNA-146a表达水平经TLR2/TLR5的配体及IL-1β刺激后可上调。说明miRNA-146a表达水平与CRP、WBC存在相关性。CRP为炎性标志物，是一种急性期蛋白，研究证实[24-26]CRP水平的高低与心血管疾病危险程度呈正相关，CRP通过参与激活补体系统、血管内皮功能损伤、粥样斑块形成及破裂过程，影响心肌梗死面积大小。本研究采用多因素线性回归分析血液miRNA-146a表达水平与各指标的相关性，显示miRNA-146a表达水平与CRP、WBC呈正相关(P<0.05),在校正了年龄、性别、糖尿病、高血压及吸烟等因素后，这种相关性依然存在。结果提示miRNA-146a表达水平与CRP及白细胞的表达情况相关，进一步表明miRNA-146a可能通过介导炎性反应参与到ACS的病理生理过程中。

心肌梗死后，心脏重塑、心肌纤维化等后续改变对心室的收缩效应有持续不断的影响，致使心肌梗死后心衰发生率高达32%～48%。实验[27]证实miRNAs过度表达与心肌梗死患者的LVEF、E/A比值呈负相关。miRNA-146a通过调控Toll样受体介导炎性因子参与到心衰的病理过程中，参与左室重构的过程[28]。Wang等[29-30]在研究单核苷酸多态性(SNP)与心衰相关性时，指出部分SNP可明显降低CAD患者左室收缩功能。本研究对STEMI患者血液中miRNA-146a基因型分别与LVEF进行比较，显示miRNA-146a与LVEF呈负相关。本研究在统计miRNA-146a表达水平与基线资料相关性时观察到，STEMI患者组中miRNA-146a表达水平与LVEF呈负相关，在校正了年龄、性别、糖尿病、高血压及吸烟等因素后，这种相关性依然存在，表明血液miRNA-146a表达水平与STEMI患者左心功能相关。

综上所述，miRNA-146a基因型与表达水平在人群中分布不同，miRNA-146a表达水平与cTnT、BNP、CRP、WBC呈正相关，与LVEF呈负相关，这些数据表明miRNA-146a 基因型及表达水平与STEMI风险相关，可以推测miRNA-146a基因型有望作为评估STEMI患者发生心衰、评估心肌梗死预后的危险因素。研究以miRNA-146a作为基因治疗靶点，为CAD及心衰的早期诊疗策略提供依据。