MiR-139 进化分析、靶基因功能预测以及在猪睾丸组织中的表达分析

2022-04-15冉茂良卞桥熊锦翼陈斌

中国畜牧杂志 2022年4期

楚丹，冉茂良，卞桥，熊锦翼，陈斌*

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128；2.畜禽遗传改良湖南省重点实验室，湖南长沙 410128）

microRNA（miRNA）是一类广泛存在于生物体内的内源性、非编码单链RNA 分子，数量多且长度较短，在生物体内广泛发挥作用，主要在转录后靶向结合靶基因并使其沉默而发挥影响基因表达的调控作用。研究表明，miRNA 参与调控细胞凋亡、神经系统发育、造血功能、脂肪细胞调控等，在众多生物学过程中通过不同的调节途径发挥重要作用。miRNA 还与肿瘤的形成和发展严密相关，其中miR-139 是近年来研究抑癌作用的热点miRNA，研究发现过表达miR-139 能够抑制肿瘤细胞的多种恶性表型，并以miR-139表达水平作为预后预测参考指标，由此看出miR-139具有潜在的临床应用价值。研究发现，miR-139 与其宿主基因的表达存在差异，在结肠癌细胞与胃癌细胞中以彼此独立的形式各自发挥作用，却在非小细胞型肺癌细胞中同步表达，这表明miR-139 作为癌症相关的miRNA 其调控受到多种因素影响，可能存在多种调控模式。不仅如此，miR-139 表达量还与少精子症呈现显著相关性，miR-139 还能一定程度预示雄性生殖问题。除癌症疾病等问题之外，miR-139 对于畜禽的繁殖以及生长发育也有重要影响，比如miR-139 被证实能靶控重要的生长发育调控因子，抑制miR-139 表达后能够显著促进山羊乳腺上皮细胞的增殖而抑制其凋亡。另外降低猪表皮干细胞中miR-139 表达水平后，能有效促进干细胞自我修复而加速伤口愈合。由此推断，miR-139 可能通过复杂的调控网络参与并调控畜禽睾丸发育和精子生成。

本研究利用多个网站数据库以及在线软件检索miR-139 及其不同物种基因组中的位置并进行多物种序列比对，选用邻近法构建距离参数为0.20 的多物种miR-139 系统发育树，并使用RT-qPCR 实验技术检测在猪7个发育阶段的睾丸组织中miR-139 的表达差异及变化，分析miR-139 在物种进化进程中的正向选择和在睾丸生长发育过程中的表达趋势，为进一步了解剖析miR-139 的功能和作用机制以及后续的遗传研究工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 miR-139 序列获得从miRBase 数据库（http://www.miRbase.org/cgi-bin/browse.pl）中下载获得所有物种的miR-139 的成熟序列及其前体序列。

1.2 miR-139 定位统计搜集到的所有物种miR-139 前体序列，利用Ensembl 数据库BLAST（http://asia.ensembl.org/index.html）程序对其基因组数据库进行搜索（BLAST Assembled RefSeq Genomes），以确定miR-139 在基因组中的位置。

1.3 miR-139 系统进化分析对所收集到的miR-139前体序列在CLustal W 在线软件上进行多序列比对（Multiple Sequences Alignment，MSA），并将比对结果输入到MEGA X 软件中，采用基于距离参数0.20的邻近法（Neighbor-Joining，NJ）构建miR-139 的系统进化树。

1.4 miR-139 在猪睾丸组织中的表达采集1 日龄（D1）、30 日龄（D30）、60 日龄（D60）、90 日龄（D90）、120 日龄（D120）、150 日龄（D150）及180 日龄（DM）7个发育阶段的正常健康沙子岭公猪睾丸组织并利用传统Trizol 裂解法提取各样品的总RNA。将总RNA 通过逆转录和反转录得到cDNA，随即进行实时荧光定量检测。内参为U6，每个实验组设3个重复。以D1 为基准采用2法计算多组别的miR-139 相对表达量。miR-139 引物序列见表1。

表1 miR-139 引物序列

1.5 靶基因预测利用miRDB（http://mirdb.org/）、miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/mamm_31/）、ENCORI（http://stafrbase.sysu.edu.cn/）4 种在线软件预测人、小鼠和大鼠3个物种中miR-139 的靶基因，通过Draw Venn Diagram 对预测到的3个物种miR-139的靶基因取交集，获得多物种间保守性高的靶基因。

1.6 miR-139靶基因GO和KEGG功能富集分析采用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）在线数据软件对已获得的miR-139 候选靶基因进行GO 和KEGG 分析，并用R 语言软件进行功能富集分析。

2 结果

2.1 miR-139 的定位在miRBase 数据库检索共获取44 条miR-139 基因的序列，广泛存在于43个物种中，均具有典型茎-环二级结构，属于高度保守的基因（表2）。以这43 种物种的miR-139 前体序列作为查询序列，分别对这些物种的基因组DNA 进行BLAST 搜索，确定各个基因序列在基因组中的区域位置。结果可知，miR-139 主要分布在哺乳纲、爬行纲和鱼类动物；在哺乳纲动物之中，灵长类动物的miR-139 大部分位于第11 号染色体，仅猕猴的miR-139 位于14 号染色体，主要分布在负链，除此之外其他哺乳动物的miR-139 在各染色体均有分布，如小鼠、褐家鼠、家犬、牛和猪分别分布在7、1、21、15 号和9 号染色体，且多位于正链；在鱼类动物中miR-139 正负链均有分布。另外，有少数物种的基因定位和正负链目前未知，如：绒毛猴、斑马鱼、斑点叉尾鲴、鲤鱼和鲑鱼。造成miR-139 在不同种群中基因组DNA 分布差异和定位未知的情况，很有可能是在漫长的基因进化历程中，发生一系列复杂的环境和生理等变化所导致的保留或丢失。

表2 miR-139 在不同物种中的分布特征

2.2 miR-139 序列同源性分析运用CLustal W 软件对miR-139 的40 种典型物种的成熟序列进行多序列比对分析（图1），结果显示，各物种序列长度（19～25 nt）相近，共有18个保守碱基，分别位于第1～11 位、13～19 位，说明miR-139 基因同源性较高，在不同物种间高度保守。比对结果还显示，miR-139 基因在其进化过程中某些碱基可能发生了缺失。例如，绒毛猴（）、倭黑猩猩（）、斑马鱼（）、热带爪蟾（）、短尾负鼠（）在第20 位、21 位和22 位分别缺失了碱基C、A 和G。此外，各物种miR-139 成熟序列的2～8 位碱基即种子序列完全相同，表现出较高的种间保守性。

图1 miR-139 基因的成熟序列比对

2.3 miR-139 进化分析为了分析miR-139 的进化关系，以miR-139 的前体序列为基准，对来自40个物种的miR-139 构建基于邻近法（Neighbor-Joining,NJ）的ML 系统发育树（图2）。由图2 可知，miR-139 主要分布在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类动物中，总体上分布为2个大分支。其中哺乳类动物聚为一个分支，在此分支中又分成2个小分支，褐家鼠、豚鼠、绒毛猴和倭黑猩猩这4个物种自成一个小分支，人和小鼠的亲缘关系可能较近；另外一个大分支主要包括鱼类、鸟类和爬行类动物，鱼类和鸟类更密切地汇聚成一个小分支，爬行类则在另一小分支中，而在这大分支中，哺乳类的短尾负鼠、袋獾和鸭嘴兽也聚入其中。由此可见，miR-139 在不同物种的进化历程中存在较大的差异性和复杂性，推测miR-139 可能经过长期的复杂进化和演变过程。

图2 多物种miR-139 基因形成的系统进化树

2.4 miR-139 在猪睾丸组织中的表达分析由实时荧光定量检测的结果（图3）可知，miR-139 在沙子岭猪睾丸组织中各个时期都有所表达，且在出生后至保育期的表达水平逐渐降低，性发育期的仔猪睾丸组织中miR-139 表达水平在120 d 上升又在150 d 有所下降，性成熟期表达水平又显著升高。由此可知，miR-139 可能对睾丸发育和性生殖调控有重要影响作用。

图3 猪睾丸组织不同时期中miR-139 的表达情况

2.5 miR-139靶基因GO功能富集分析使用TargetScan 6.2软件预测到153个候选靶基因，对这些靶基因进行GO功能富集分析（图4），结果表明，生物学过程中miR-139 的靶基因主要参与RNA 聚合酶II 启动子转录正调控、DNA 模板转录的正负调控、蛋白质泛素化、轴突导向等；细胞成分层面，在细胞核、细胞质和胞外外泌体上集中散布；分子功能层面，与DNA、RNA 的poly A 端、金属离子结合的靶基因显著富集。GO 富集结果显示，miR-139 的靶基因主要起结合、转录前调节的作用，并且大多数在细胞及其外泌体中发挥功能。

图4 miR-139 靶基因的GO 分析

2.6 miR-139 靶基因KEGG 富集分析对TargetScan 6.2软件预测到的153个候选靶基因进行KEGG 通路分析，共注释到18 条通路（图5），结果表明，预测到的miR-139 靶基因在10个信号通路中显著富集，主要在沙门氏菌感染、催乳激素信号通路、癌症通路、胰岛素抵抗、粘着斑、结直肠癌、cAMP 信号通路、ARVC 通路、AMPK 信号通路和黏着连接发挥作用。其中多数基因富集在催乳激素信号通路、cAMP 信号通路、AMPK 信号通路和黏着连接处，对调控畜禽繁殖和生长发育进程有重要作用。

图5 miR-139 靶基因的KEGG 分析

2.7 miR-139 靶基因保守预测由于miR-139 在物种间的高保守性，为避免单个网站预测结果的偶然性和假阳性，利用miRDB、miRWalk、TargetScan、ENCORI 4个靶基因预测网站中人、小鼠和大鼠3个物种miR-139靶基因的预测结果取交集实现物种猪miR-139 靶基因的预测。得到靶基因统计表（表3）和韦恩图（图6），4 种软件靶基因取交集获得保守猪源靶基因共25个。

图6 4 种软件对miR-139 靶基因预测结果

表3 miR-139 靶基因统计

3 讨论

microRNA 是一类重要的内源性非编码单链RNA分子，数量多且短小，在生物体内广泛发挥作用，它们通常与mRNA 的5'-UTR 或3'-UTR 结合发挥转录后水平调控作用，是mRNA 基因表达或沉默的关键调控因子，参与动植物体多种生物学过程并对其生长发育起重要作用。本研究利用miRBase 数据库网站搜索miR-139，从已测序的43个动物物种中获得了44 条miR-139 基因序列，说明其广泛分布于不同物种中。多物种序列比对结果和系统进化发育树显示，miR-139 经历了漫长且复杂的进化进程，并在进化过程中有多次碱基复制、增加或者缺失，但碱基第1～11 位、13～19 位完全一致，突变率低，多物种间此序列高度保守。而miRNA 与miRNA 之间往往又存在着复杂的调控通路或网络，彼此之间共同作用进而在生物体内发挥影响作用。研究发现，miRNAs 在睾丸组织发育和精子生成的各个阶段中发挥着关键的功能作用。对此，冉茂良从不同发育日龄的公猪睾丸组织中鉴定出329个差异表达的miRNA，Chen也对猪睾丸间质细胞进行了miRNA 文库分析，并发现存在68个miRNA 差异表达。本研究中也发现，miR-139 在猪睾丸组织发育的不同时期表达变化差异较大且与卞桥研究中miRNA-130a/b 基因家族在猪睾丸组织发育的不同时期表达趋势一致。Luo 等人研究也发现miR-130a 能够通过TGF-/smad5 信号通路和PI3K/AKT 信号通路实现对猪睾丸支持细胞的生长调控，对精子发生过程有重要影响作用。

为更进一步探究miR-139 在猪睾丸组织中的功能地位和作用途径，本研究对miR-139 进行多网站靶基因预测并进行GO 和KEGG 分析。分析结果表明，miR-139 可能主要起结合、转录前调节的作用，并且大多数在细胞及其外泌体中发挥功能。注释到的信号通路，除癌症发展相关途径以外，cAMP 信号通路、AMPK 信号通路等多个信号途径都参与畜禽繁殖和生长发育的影响调控过程。利用多个在线网站预测到的保守猪源靶基因中，、、、、等多个靶基因对畜禽生精、排卵或泌乳过程有重要调控作用。以上结果均提示miR-139 在调控雄性生殖发育和睾丸精子生成过程中可能有重要作用。

研究发现，miR-139 是一种与癌细胞高度相关的miRNA 分子，它在多种肿瘤组织中低表达，并能与其靶基因靶向联结来调控肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡，如靶向结合、、、和分别对乳腺癌、前列腺癌、胃癌胶质母细胞瘤和肝癌的发生有重要影响作用。因此miR-139 也被认为是肿瘤疾病相关的重要诊断基因，在未来临床治疗和预后方面有很大的功能作用以及应用前景。除与癌症形成发展密切相关以外，miR-139 对于畜禽的繁殖分泌等性状也有重要影响。有研究发现，miR-139 还能够与（Growth Hormone Receptor）和（Type I Insulin-Like Growth Factor Receptor）的3'UTR区靶向结合抑制相关通路，进而影响奶牛乳腺上皮细胞的表观特征使其增殖力下降并降低-酪蛋白分泌水平，影响奶品质。除GHR 和IGF1R，Zhou 等人发现miR-139 还能与（Dihydrofolate Reductase）的3'UTR区靶向结合，调控牛骨骼肌源性卫星细胞的增殖和分化过程。因此，推测miR-139 可能与靶向结合调控相关细胞的增殖与凋亡进而影响睾丸发育和精子发生过程。