冻融卵裂期优质胚胎过夜培养后形成桑椹胚对临床妊娠结局的影响

雷鑫，冯晓琴，任文娟

(山西省人民医院生殖医学科，太原 030012)

随着体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术的发展，冻融胚胎移植(FET)技术受到越来越多的关注[1]。FET可以增加促排卵周期的妊娠机会，避免胚胎浪费，同时可以降低卵巢过度刺激综合征(OHSS)的发生率[2]。影响FET成功的因素很多，其中冻融胚胎的发育潜能尤为重要[3]。新鲜周期卵裂期优质胚胎较非优质胚胎有更好的发育潜能及妊娠结局。卵裂期胚胎预测发育潜能的复杂性以及延长培养到囊胚期表观遗传性质的改变，使得人们开始关注移植桑椹胚的优势。本研究通过对我中心FET周期的回顾性分析，探讨冻融卵裂期优质胚胎过夜培养后发育为桑椹胚的情况，并进一步研究移植桑椹胚的价值以及在FET周期中的应用。

资料与方法

一、研究对象

选择2014年1月到2019年12月在本中心行FET的患者为研究对象。

纳入标准：女方年龄≤38岁；内膜准备方案为激素替代周期；移植2枚优质胚胎；胚胎解冻后经过夜培养后移植；经过夜培养后，2枚胚胎卵裂球均未生长或者均生长。

排除标准：移植1枚或者3枚胚胎；复苏胚胎卵裂球有损伤；内膜准备方案是自然周期或诱导排卵周期；胚胎解冻后当日移植；经过夜培养后只有1枚胚胎卵裂球生长；反复种植失败的患者；女方存在明显影响妊娠的因素。

共纳入311个周期，根据过夜培养后胚胎卵裂球是否分裂生长分为2组：A组(生长组，n=275)和B组(未生长组，n=36)。根据冻融胚胎过夜培养后是否发育成桑椹胚以及达到桑椹胚的胚胎个数将A组分为A0组(2枚胚胎均未发育为桑椹胚，n=82)、A1组(只有1枚胚胎达到桑椹胚，n=105)和A2组(2枚胚胎均达到桑椹胚，n=88)。

二、研究方法

1.胚胎冷冻和复苏：胚胎冷冻和复苏均使用Kitazato Kit(KITAZATO，日本)，按照说明书操作。胚胎冷冻：首先将卵裂期胚胎置于ES液中4 min，平衡结束后将其投入VS液中，吹洗数次，并在30 s内将胚胎滴到冷冻载杆尖端位置，迅速投入液氮并套上套管进行保存。胚胎复苏：整个操作均在37℃台面上进行。首先将冷冻载杆从液氮中取出，迅速放于TS液待胚胎脱落(1 min)，将胚胎依次移入DS液(4 min)、WS1液(5 min)和WS2液(2 min)中，最后移入预先在37℃、5% CO2培养箱内平衡好的胚胎培养液中过夜培养。

2.内膜准备：FET周期内膜准备均采用激素替代治疗。从月经第3天开始口服戊酸雌二醇片(补佳乐，拜耳，德国)1 mg，bid；7～8 d后B超监测子宫内膜生长情况，并根据内膜情况调整药物剂量；当内膜厚度≥8 mm时，加用黄体酮(黄体酮注射液，浙江仙琚制药)进行内膜转化，直至移植日，总共5 d，每天的剂量分别是20 mg、40 mg、40 mg、60 mg和60 mg；移植后继续黄体支持2周，若血清HCG为阳性，则继续黄体支持8周。

3.冷冻胚胎选择：根据取卵后第3天(D3)胚胎形态和碎片多少评价胚胎质量，将由双原核发育而来的Ⅰ级和Ⅱ级胚胎定义为优质胚胎。Ⅰ级胚胎：≥8细胞，卵裂球大小均匀，无空泡，无多核，碎片≤5%；Ⅱ级胚胎：≥7细胞，卵裂球大小均匀或大致均匀，碎片为5%～10%，有少量小空泡，无多核。

4.妊娠结局的评价：在胚胎移植后第14 天测定血清HCG水平。如血清HCG阳性，3周后复查超声，见妊娠囊者判定为临床妊娠。胚胎种植率=妊娠囊总数/移植胚胎总数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期总数/FET周期总数×100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；流产率=妊娠28周前流产周期总数/临床妊娠周期数×100%；早期流产率=妊娠12周内自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率=发生活产的周期总数/FET周期总数×100%；早产率=发生早产的周期总数/活产周期总数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、患者一般情况比较

共纳入311个复苏双胚胎周期，临床妊娠周期数为177个，临床妊娠率56.9%。

根据复苏后过夜培养胚胎卵裂球生长状况分为A组(生长组，n=275)和B组(未生长组，n=36)。两组患者间平均年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、基础FSH水平、原发不孕比例、IVF比例、获卵数、移植日子宫内膜厚度比较均无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者一般情况比较[(-±s)，%]

二、冻融胚胎过夜培养后卵裂球生长状态对临床结局的影响

过夜培养后，A组(生长组)胚胎种植率、临床妊娠率和活产率均显著高于B组(未生长组)(P<0.05)，而组间流产率和早产率均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 两组患者妊娠结局比较(%)

三、冻融胚胎过夜培养后发育为桑椹胚对临床结局的影响

根据过夜培养后发育至桑椹胚情况将A组分为A0(无桑椹胚)、A1(1枚桑椹胚)和A2(2枚均桑椹胚)3个亚组。A0组胚胎种植率、临床妊娠率、多胎妊娠率以及活产率均显著低于其他2组(P<0.05)，而A1组与A2组间无显著性差异(P>0.05)；3组间流产率、早期流产率以及早产率均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 过夜培养后卵裂球生长组的亚组妊娠结局比较(%)

讨 论

近年来，随着人类辅助生殖技术的不断发展和完善，冷冻胚胎移植技术已成为辅助生殖技术的重要组成部分。FET不仅降低了胚胎浪费的现象，而且可以预防OHSS，避免高孕酮水平影响子宫内膜容受性、薄型子宫内膜、取卵并发症等情况，弥补了新鲜周期的不足。

目前对于冻融卵裂期胚胎在解冻后有两种培养方案：一种是在移植当天进行解冻，培养2 h后进行移植；另一种是在移植前一天解冻，过夜培养后第2天进行移植。研究表明，过夜培养可以进一步观察到冻融胚胎复苏之后的发育潜能，过夜培养后继续生长的胚胎有更高的胚胎种植率和临床妊娠率[4]。因此我中心常规采取解冻/复苏后过夜培养，仅对于那些移植前一天是周末的患者，会选择移植当天解冻。

在FET周期中，很多因素会影响最终的妊娠结局，其中移植胚胎发育潜能是影响FET周期结局的主要因素。有研究表明冻融胚胎复苏后卵裂球进一步生长可以使胚胎发育与子宫内膜更同步，可以提高临床妊娠率[5]。延长冻融胚胎体外培养时间的好处是可以帮助实验室筛选出发育潜能较好的胚胎，还可以使移植胚胎与子宫内膜更趋于同步，选择此类胚胎进行移植有助于提高临床妊娠率和种植率，降低流产率。在新鲜周期移植中，优质胚胎通常有更好的发育潜能和临床妊娠结局[6]。因此优质胚胎冷冻后，经过复苏并在体外进行一定时间的培养，可以进一步观察其生长情况以预测其发育潜能。有研究发现优质胚胎复苏后发育速度不同可能影响FET妊娠结局，无损伤、发育速度快的胚胎可以有更好的妊娠结局[7-8]。

胚胎细胞融合，又称致密化作用。胚胎发育至细胞融合期，各种细胞间连接方式逐步建立起来，基因组转录激活已经启动，此时可以选择发育潜力更高的胚胎。卵裂期胚胎预测发育潜能的复杂性以及延长培养到囊胚期表观遗传性质的改变，使得人们开始关注到移植桑椹胚的优势。然而，虽然这个时期是卵裂期发育为囊胚期的必然阶段，目前仍只有很少关于FET周期中移植桑椹胚的妊娠结局的报道。

本研究发现卵裂球分裂生长组(A组)的胚胎种植率、临床妊娠率以及活产率均高于无卵裂球分裂生长组(B组)，差异有统计学意义(P<0.05)。这与刘晓景等[9]的研究结果一致，提示冻融优质胚胎过夜培养后是否继续生长可以预测胚胎的发育潜能。有研究表明，发育迟缓的胚胎染色体非整倍体率会增加，胚胎发育潜能降低[10]，这可能就是冻融胚胎过夜培养后卵裂球未分裂生长的胚胎临床妊娠结局差的原因。提前解冻卵裂期胚胎过夜培养后的进一步发育情况与临床结局密切相关，选择发育良好的胚胎能有效改善妊娠结局。

本研究随后进一步分析了移植桑椹胚以及不同数目桑椹胚的临床妊娠结局。经过分析发现：移植2枚胚胎时，包含桑椹胚的移植组其胚胎种植率、临床妊娠率以及活产率均较没有桑椹胚组显著增加，说明冻融优质胚胎过夜培养后若达到桑椹胚状态可以预测有更好的妊娠结局；与2枚桑椹胚移植组相比，包含1枚桑椹胚的移植组其妊娠结局无统计学差异，仍有较高的种植率和临床妊娠率。以上结果提示，移植2枚过夜培养后的胚胎时，至少有1枚能够发育为桑椹胚即可以得到较好的临床妊娠结局。说明冻融优质胚胎卵裂球能够发育为桑椹胚对预测胚胎发育潜能具有重要的参考价值。

多胎妊娠是IVF-ET常见的并发症，会导致一系列母婴并发症显著增加。降低多胎妊娠的发生，避免IVF-ET不良孕产期结局成为辅助生殖治疗中亟待解决的问题[11-12]。有研究显示IVF-ET中影响多胎妊娠最关键的因素就是胚胎移植数目[13]。2018年《关于胚胎移植数目的中国专家共识》[14]指出，在辅助生殖助孕过程中减少移植胚胎数目是降低多胎妊娠的最有效措施。然而全国每个生殖中心情况不一，如何在不影响累积妊娠率的前提下，制定符合本中心的胚胎移植数目的方案，选取发育潜能更高的胚胎进行单胚胎移植，降低多胎妊娠率，成为大家关注的焦点。提高胚胎质量并精准选择高质量胚胎移植是不降低单胚胎移植临床妊娠率和活产率的重要方法[15]。本研究中，尽管包含1枚桑椹胚移植组的妊娠结局与2枚均为桑椹胚移植组相比差异无统计学意义，但多胎率呈某种较明显的下降趋势。因此，在复苏2枚冻融优质胚胎过夜培养后形成至少1枚桑椹胚的情况下，可以考虑移植其中1枚桑椹胚或者1枚桑椹胚与1枚非桑椹胚搭配移植，从而降低多胎妊娠风险。而另1枚桑椹胚可以选择冻回或是继续培养观察其进一步发育成囊胚的潜力。

Abuzeid等[16]的一项前瞻性研究显示，选择性单囊胚移植可以达到提高临床妊娠率以及活产率、降低多胎妊娠率的目的。Li等[17]认为，D4桑椹胚移植可达到与D5囊胚移植相似的妊娠结局。与移植桑椹胚相比，移植囊胚存在不利的方面。囊胚培养延长了体外培养时间，并不是所有胚胎都能发育至囊胚阶段，最终导致胚胎利用率降低甚至无可移植胚胎而增加周期取消率；而且体外培养体系只是体内环境的模拟，并不能达到与体内完全一致的状态；同时体外培养时间的延长还增加了表观遗传改变的风险[18]。另外，由于融合的发生，使得桑葚胚出现一个相对大的卵周间隙，移植前辅助孵化对卵裂球的干扰风险会降低，使得辅助孵化更加容易和安全[19]。本研究提示过夜培养后的优质胚胎如发育为桑椹胚则妊娠率明显提高。由于获得单胎足月活产已成为全球辅助生殖技术的目标和趋势，因此在移植策略的选择中，可以通过过夜培养观察是否能够成为桑椹胚，进而选择合适的移植胚胎数目。可以在保证妊娠率的同时降低多胎妊娠风险，尽可能地得到更多健康的婴儿及更少的孕产期并发症。

综上所述，冻融优质胚胎过夜培养后发育为桑椹胚，预示着有更好的临床妊娠结局，但是移植2枚桑椹胚会导致多胎妊娠率增加。因此对于移植时已有桑椹胚形成的患者，可以考虑行选择性单胚胎移植，以降低多胎发生率。