基于AFLP标记的薄壳山核桃种质资源遗传多样性分析

2022-04-14韩传明王翠香闵旭峰王清海

江苏林业科技 2022年1期

梁燕，韩传明*,孙超，王翠香，闵旭峰，王静，王清海

(1.山东省林业科学研究院，山东济南 250014；2.枣庄市山亭区自然资源局，山东枣庄 277500)

薄壳山核桃 (CaryaillinoensisK.Koch)，属胡桃科山核桃属，又名美国山核桃、长山核桃、碧根果和长寿果等，英文名 pecan[1]，是优良的经济林树种，在用材和林果方面表现优异。2017年，美国出口的薄壳山核桃价值达到3亿美元，其中有76.37% 销往中国。薄壳山核桃有比较广泛的栽培分布范围，适宜于大陆性气候带的地区进行引种栽培，纬度 25—35°范围里的地区生长结实情况最佳[2]。据文献记载，江西于 1890 年开始引种，是我国最早引种该树种的省份之一，后在江苏的江阴、南京、浙江杭州和福建莆田等地栽植[3]。薄壳山核桃雌雄同株异花，雌雄异熟，风媒传粉，多属于异树异花授粉，因此，薄壳山核桃是高度杂合的多年生植物，优良单株种质资源的收集和分子标记意义重大。

同其他多年生木本植物相比，目前薄壳山核桃的分子标记研究报道主要有Grauke等筛选出19对 SSR 引物用于48个薄壳山核桃品种的鉴定[4]，焦思宇等利用ISSR技术分析了阜阳林科站引进的33个薄壳山核桃品种的遗传多样性[5]，张日清等进行了美国山核桃群体遗传多样性的RAPD分析[6]。 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 分子标记技术具有带型丰富、可靠性强、可重复性高、灵敏度高等特点，在番石榴[7]、鳄梨[8]、滇山茶[9]、楸树[10]、银杏[11]等木本植物遗传多样性分析和遗传结构研究中已成熟应用。为了明确山东地区引进的薄壳山核桃种质遗传多样性和亲缘关系，本研究以山东省林业科学研究院引种的 30 个优良薄壳山核桃品种(系)为对象，利用 AFLP 分析标记技术，准确了解和评价种质资源的遗传背景、遗传结构、品种间的遗传距离，建立DNA指纹图谱，为进一步开展薄壳山核桃的新品种选育、品种鉴定和种质资源保护提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

30份供试材料采自山东省林业科学研究院济南市莱芜区、泰安市岱岳区、聊城市冠县薄壳山核桃种质资源圃，具体来源见表1。于2020年4月分别采集各品种(系)树冠外围新梢嫩叶作为试验材料，用酒精洗净后晾干放入硅胶干燥剂中保存，带回实验室备用。

表1 供试薄壳山核桃品种(系)及其来源

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与检测取干燥好的叶片材料0.3 g，液氮冷冻后研磨成干粉，DNA采取改良的CATB法提取[12]。配制0.8%的琼脂糖凝胶，电压180 V 电泳时间40 min，在凝胶图像分析系统下进行DNA检测。

1.2.2 AFLP体系的建立从64对引物组合中筛选出9对(见表2)EcoR I/Mse I 引物用于本次研究。

试验条件：对供试样品采用EcoR I /Mse I双酶切，酶切和连接、预扩增、选择性扩增参考王东升[13]紫椴和野核桃AFLP遗传多样性研究中的反应体系。

1.2.3 电泳分析选扩产物的检测(采用ABI PRISM 377 sequencer)。预电泳 20—30 min、点样、电泳2.5 h(电压1 200 V)。ABI 377测序仪进行AFLP多态性分析。

1.2.4 数据分析用GENESCAN3.1软件打开胶图，对胶图进行数据提取，设置参数计算多态性比率PPBs，并在假定哈迪-温伯格平衡的前提下计算其有效等位基因(Ne)、基因多样度(H)和Shannon信息指数(I)。通过Binthere软件提取样品的各片段大小的结果，EXCEL转换将表内的数值不为0转换为1(数值为0的不转换)，从而生成由“l”和“0”组成的原始矩阵，用NTSYSpc-2.11F软件进行数据分析。对原始矩阵用SimQual程序求DICE相似系数矩阵，并获得相似系数矩阵。用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类图，用EIGEN模块进行基于Jaccard遗传相似系数的主坐标分析。

2 结果与分析

2.1 AFLP扩增多态性分析

利用筛选出的9对EcoR I/Mse I 引物组合(见表2)对30个薄壳山核桃基因组DNA进行AFLP扩增多态性分析(如图1)，扩增获得的条带清晰、位置一致性良好。总体上，9对引物组合共扩增出1 425个条带，多态性条带1 381个，其中有4个引物组合的多态性比率达到100%。E-ACG/M-CAA扩增条带最多，为192个，多态性比率亦为100%，效果最好，E-ACC/M-CAC扩增条带数188，多态性条带数为157，比率为83.51%，虽然比例较低，但数量较多。9对引物组合整体平均条带数为158.3，平均多态性比例为96.9%，多态性较好，满足试验需要。

图1 30个薄壳山核桃品种(系)的荧光AFLP电泳图谱(引物组合E-ACG/M-CAA)

表2 AFLP分析引物组合及其选择性扩增结果

2.2 遗传多样性分析

基于等位基因频率计算有效等位基因数(Ne)、基因多样度(H)及Shannon信息指数(I)是进行遗传多样性水平评估的重要方式[14]。如表3所示，30个薄壳山核桃品种(系)利用9对引物组合所检测到的不同位点的观测等位基因数(Na)为1.652 8—1.888 9，平均1.710 3；有效等位基因数范围1.182 1—1.306 8，平均1.240 3；基因多样度范围0.120 1—0.190 9，平均0.152 2；Shannon信息指数范围0.200 0—0.304 8，平均0.245 5。9个引物组合中，E-ACG/M-CAA与E-ACA/M-CTT结果最好，同时2个引物组合多态性均为100%。

表3 30个薄壳山核桃品种(系)遗传多样性指标

2.3 遗传相似系数与聚类分析

由表4可知，30个供试样品遗传相似系数范围为0.746 4—0.885 3，变异范围为0.138 9。‘钟山’与‘Stuart’的相似系数为0.885 3，说明2个品种遗传关系较近；‘小糙皮1’与‘金华’遗传相似系数为0.746 4，2个品种遗传关系较远；‘小糙皮2’与‘安农3号’遗传相似系数为0.749 0。与其他品种间相比，小糙皮系列遗传相似系数整体较小。

基于遗传相似系数，对30个薄壳山核桃品种(系)聚类，见图2。在遗传相似系数0.796处，30个薄壳山核桃品种分为3个组，A组中包含17个品种，其中有‘Stuart’‘Caddo’‘Shoshoni’‘Tejas’‘Mahan’‘Pyzner’‘Wichita’‘Western’‘Baker’9个美国品种，‘Stuart’‘Western’和’Desirable’‘Wichita’是美国主栽品种的前4名[15-16]，聚类在一起，说明其遗传关系较近，具有丰产稳定的特点，3号、9号、28号、YXG、64号、YL 6个优株，‘钟山’和‘云光’2个品种与丰产稳定的美国薄壳山核桃聚在一起，需重点观察其结果丰产特点；B组含有11个品种(系)，‘Mohawk’‘San Saba Improved’‘Pawnee’‘Starking Hardy Giant’中 ‘Mohawk’‘Starking Hardy Giant’‘Pawnee’在美国均表现出坚果早熟的特点[15-16]，根据聚类结果看，‘金华’[17]与‘Starking Hardy Giant’聚在一起，2者遗传关系较近，‘绍兴’与‘Mohawk’这2者遗传关系较近，‘安农3号’与‘安农5号’聚在一起，‘安农3号’在安徽合肥表现出速生的特点[18]；其中‘小糙皮1’和‘小糙皮2’单独分为C组，与其他品种距离较远，‘小糙皮1’与‘小糙皮2’遗传相似系数为0.807 1。小糙皮系列与其他品种遗传相似系数整体较小，是很好的亲本。目前，许多科技工作者正在从薄壳山核桃与小糙皮山核桃、薄壳山核桃与大糙皮山核桃的二代杂种中，选择优良品种，在寒冷地区发展有价值的薄壳山核桃品种[15]。

图2 基于AFLP分析的30个薄壳山核桃品种(系)UPGMA聚类图

2.4 主坐标分析

基于AFLP分子标记的主坐标分析(如图3)，30个薄壳山核桃发散均较好，分布较均匀。30个薄壳山核桃被更直观地分成3组，分别包含19，9，2个品种(系)。分组结果和UPGMA聚类结果基本一致，稍有不同的是品种‘Pawnee’与‘Starking Hardy Giant’，在图3中可以看到2个品种在组的边缘，‘Pawnee’处在较为中间的位置，而‘Starking Hardy Giant’与‘Western’、‘Baker’距离较近。小糙皮系列与其他品种距离较远，与已得结果一致。

图3 基于AFLP分子标记的30个薄壳山核桃品种(系)二维主坐标分析图

3 讨论

本研究中筛选的9对AFLP引物组合平均多态性比例为96.9%，多态性较好，其中有4个引物组合的多态性比率达到100%。E-ACG/M-CAA扩增条带最多，为192个，多态性比率亦为100%，效果最好。王东升等利用AFLP分子标记技术筛选的8对引物组合多态性比率为97.2%[19]，和本研究中的结果差不多，100%引物组合为1对，远低于本研究中的4对，说明9对引物多态性较好。Hamrick研究认为基于AFLP分析，多数多年生木本植物平均多态性位点比率为65%，平均每个位点观测等位基因数(Na)为2.2，平均每个位点的有效等位基因数(Ne)为1.24[20]。本研究中，30个薄壳山核桃品种(系)利用9对引物组合所检测到的不同位点的观测等位基因数1.710 3，有效等位基因数1.240 3，基因多样度0.152 2，Shannon信息指数0.245 5，30个品种观测等位基因数(Na)略低于多年生木本植物平均值，Ne和多年生木本植物平均值相近，说明30个薄壳山核桃的遗传丰富度中等，结果可信。有效等位基因数(Ne)其数值越接近观测等位基因数(Na)，表明等位基因在群体中分布越均匀，遗传多样性越好[21]。研究中Ne与Na数值接近，说明有效等位基因分布较为均匀，但整体数值较小。30个品种标记结果高于何建等对30个新疆核桃品种利用AFLP分子标记结果(Ne=1.208 5，H=0.129 7，I=0.206 6)[22]。与其他树种相比，低于马庆国等[23]对75个金丝楸AFLP分子标记结果(Ne=1.36，H=0.28，I=0.43)。

薄壳山核桃属于多年生的木本植物，大部分品种雌雄异熟，异树异花授粉。30个供试样品遗传相似系数范围为0.746 4—0.885 3，变幅较小，说明样品间亲缘关系较近，遗传距离普遍较小。焦思宇等对33份薄壳山核桃ISSR分析结果中遗传相似系数变幅为0.17[5]，与本研究结果相差不大。李晖等以 161 个美国山核桃品种及株系、1 个核桃品种和 1 个山核桃品种为试材，品种间相似系数范围为 0.29—0.94[24]，变幅显著较高，可能与样本中有核桃和山核桃有关。30个薄壳山核桃对于种质资源来说样本量相对较小，为了达到既定的育种目标，需扩大引种资源范围，进一步调整资源结构。在以后的研究中，宜扩大样品范围，采用高通量技术方法等更深入探讨表型和分子标记的对应联系，为育种提供更加精确的理论基础。

通过NTSYSpc-2.11F软件进行的 UPGMA聚类分析和PCA主坐标分析结果表明，以小糙皮系列品种为亲本与其他薄壳山核桃品种杂交，更易获得有利变异，可结合‘Stuart’‘Western’‘Wichita’品种的丰产稳定特点，和 ‘Mohawk’‘Starking Hardy Giant’‘Pawnee’坚果早熟的特点，‘安农3号’速生的特点，培育出适合山东省栽培的优良品种。主坐标分析从不同的方向和层面，提供薄壳山核桃各种质之间和群组之间的关系；在排序图上品种的位置越近，它们的遗传组成越相似[25]，分析结果可以为育种和种质资源保护提供参考，可以更直观地表现出品种间遗传结构特点。