重组酶扩增技术及其在病原检测中的应用

刘可欣，王倩颖，杨森，刘俊峰，胡建军，张淑琴※

(1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

最近几年，重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification,RPA）因其可使核酸在体外等温条件下就可以进行扩增，且具有敏感度高、检测用时短、成本低、特异性强和便携等特点，有望成为取代聚合酶链式反应（PCR）技术的新的核酸体外扩增技术。RPA技术是2006年英国剑桥科学家Piepenburg[1]等研发的一种体外核酸扩增检测新技术。英国TwistDX公司于2014年生产了具有可进行商业生产检测RPA的试剂盒。该试剂盒大大推动了RPA检测技术在农业生产、医学诊断以及生物检测等众多领域中的推广应用[2]。

1 重组酶聚合酶扩增技术的原理及特点

1.1 重组酶聚合酶扩增技术的原理

RPA基本原理是依赖于DNA修复中的一个关键过程——同源重组。其扩增原理是重组酶蛋白（recombinant enzyme protein,REP）与寡核苷酸引物在链置换DNA聚合酶及能量作用下发生结合产生重组酶丝状复合物，该复合物在双链DNA模板中寻找靶点。重组复合物在定位后引起链发生置换反应后形成D环结构，为避免出现在新链DNA还未合成时就发生母链聚集配对的现象，单链结合蛋白（single-stranded binding protein,SSB）与发生置换反应的模板单链DNA结合[3]，之后重组酶丝状复合物扫描DNA模板链，当扫描识别到的序列可与设计的引物互补配对时，负责碱基配对的REP可通过与SSB相互结合，阻止拦截细胞核内DNA水解酶降解单链DNA[3]，最后DNA聚合酶在引物的3'端添加相应碱基片段进行DNA复制并延伸。

1.2 RPA引物探针设计

引物在RPA反应中也同样重要。RPA的引物与传统常规PCR引物并不完全相同。当我们设计RPA引物的时候，RPA引物长度需要在30～35 bp之间，以便于重组酶与引物形成复合物。因其引物比PCR技术长，所以特异性也较之更好。引物片段过短（15 bp），则会导致反应重组率降低；引物片段过长（45 bp），虽然能够使用，但是极易产生二级结构及潜在的引物现象[4]。一般而言，两个RPA引物产生的扩增产物建议不超过500 bp，最适合的长度为100～200 bp。引物选择基本分为3个步骤，首先选择靶区域，之后设计候选引物，最后进行实验筛选。因为现在科研人员对RPA技术的研究了解还不透彻，还没有专门软件可以对RPA引物进行设计，但有一些规则可遵循，即引物长度最好在30～35 bp之间；5'端的3～5个碱基要避免出现鸟嘌呤（G），3'端最后3个核苷酸最好是鸟嘌呤（G）或胞嘧啶（C），鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）的含量应在30%～70%之间，同时无需考虑引物退火温度，但要求引物的浓度范围在400～500 nmol/L之间[5]。

大多数常用的PCR探针系统不适用于实时荧光定量RPA（Real time-RPA,RT-RPA）反应，确切地说利用聚合酶的5'至3'聚合酶活性的探针系统不能用于RPA反应。Real time-RPA探针一般分别在5'端和3'端设计1个荧光基团和荧光猝灭基团，还有与两个基团相连的中间位置设计脱碱基位点（abasic site）类似物（THF）。在一个反应中，推荐探针浓度为120 nmol/L，有时调整探针浓度会促进反应的进行，因此可在50～150 nmol/L浓度范围内，对探针浓度进行优化[6]。

2 RPA产物的检测

RPA技术可以和多种检测方法相结合。常见的有凝胶电泳检测技术、横向流动试纸条检测技术（RPALFD）、Real time-RPA和电化学检测等。凝胶电泳检测法成本低，所用设备简单，但缺点是为避免电泳结果出现抹带等现象，检测前需要对扩增产物进行纯化。

RPA-LFD技术以RPA技术扩增原理为基础，引物带有生物素标志，探针带有羧基荧光素（FAM）标志，引物、探针与靶核酸发生扩增反应，使最终扩增产物同时携带FAM和生物素标志[7]。将横向流动试纸条检测与RPA技术相组合，扩增与检测合计在30 min内，可以实现低至1～10 DNA拷贝的检测限。此方法十分适用于基层进行检测，因为此方法无需提前对操作员进行专业培训，也不需要昂贵的高端复杂精密仪器，仅通过肉眼就可以观察出检测结果，并且，此方法所用成本比实时荧光定量检测法低。邓王平等[8]应用此技术检测了日本血吸虫。

RT-RPA检测法目前已被广泛应用。RPA的实时荧光检测应选用特定探针，如Exo探针。Exo探针[9]是与靶序列具有同源性的寡核苷酸，含有脱碱基位点THF，两侧分别有一个荧光基团和淬灭基团，3'端带有阻断物以避免探针延伸。当探针不反应时，荧光基团信号被淬灭基团压制；而Exo探针与靶序列结合时，核酸外切酶III在THF位点切割探针，荧光基团与淬灭基团分离，实现荧光信号与扩增产物的同步累积。实时荧光RPA不同于RT-PCR，其一直处于一个恒定的最佳反应温度进行，可连续加入样本扩增。

电化学检测利用电化学活性物质产生与核酸扩增有关的信号。大多数电化学检测RPA的方法都是通过RPA-酶联免疫吸附测定或RPA-酶促测定来检测电流信号[10,11]。Ng等和Lau等[12,13]已经采用金纳米粒子作为RPA扩增子检测的信号传感器。金纳米粒子可以选择性地结合RPA扩增子，并将RPA扩增子的浓度转移到可测量的电化学信号中，而这种电化学检测方法有着较高的分析灵敏度。Ng等[12]能够检测到低至1CFU的结核分枝杆菌DNA，Lau等[13]可检测到低至214 pM的假单胞菌DNA。显然RPA-电化学检测的高分析灵敏度是一个优势，同时其检测快速，低成本，适用于现场检测。

3 RPA的特点

RPA对温度要求不高，在37～42℃条件下可以恒温扩增。PCR技术需要一个较高温度循环使模板变形扩增，环介导等温扩增（LAMP）要在65℃条件下退火，RPA技术并不需要，这使得RPA技术操作与其他扩增技术相比更为简单，并且减少了实验所需成本；RPA不仅可扩增RNA，也可以扩增DNA[14]，而核酸序列依赖性扩增却只能用于检测RNA；RPA耗时短，在5～20 min之内就可以完成反应，比PCR、环介导等温扩增、依赖核酸序列的扩增等技术节省了很多时间；RPA对技术操作要求不高，不受检测场地限制，并且应用RPA技术检测时也不需要十分高精尖的设备，甚至可以直接利用人体腋下温度对样品进行检测[15]；RPA技术对检测样品要求也很低——模板可直接使用经简单裂解液裂解60 s的样品，故十分适用于现场实地检测；RPA技术的特异性佳，灵敏度高[16]，其特异性可以与RT-PCR相媲美[17]。

RPA技术扩增产物在进行凝胶电泳检测时，为了避免其他成分对结果造成的影响，需要对产物进行纯化。RPA技术单份检测费用不低，因为现阶段使用的RPA试剂均产自英国，且目前没有一款专业的软件能够设计和筛选RPA技术的引物和探针。RPA技术不能检测较短序列的DNA或RNA，而且在检测大量样品时，很难控制反应同时进行。

表1 RPA与其他核酸检测技术的比较Table 1 Comparison of RPA and other nucleic acid isothermal amplification methods

4 RPA技术在兽医方面的应用

4.1 RPA对病毒的检测

姜一瞳等[28]建立了一种RPA方法针对检测犬细小病毒（CPV）。该实验引物序列的设计基于CPVVP2基因的保守区序列，通过优化不同反应条件，建立了犬细小病毒的RPA检测方法。该方法最适反应温度为38℃，恒温反应，反应15 min后即可特异、快速地检测出犬细小病毒。该方法特异性强，敏感度高，同时使用普通PCR法、胶体金和RPA法检测疑似CPV感染的临床样品，普通PCR和胶体金的检出率（82%、76%）明显低于建立的RPA方法的阳性检出率（88%）。故该实验建立的检测犬细小病毒方法简单易于操作，反应灵敏度高，结果真实可信，适用于CPV的快速检测。林彦星等[29]建立了非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）核酸LFD-RPA的快速检测法。该方法以非洲猪瘟病毒B646L基因保守区序列为依据，设计nfo RPA特异性引物和探针，结果表明，该方法高特异性，且不与PCV2、CSFV、PRRSV、FMDV及SVA等病原核酸发生反应；最低可以检测到1.57 102copies/L重组质粒pUC-B646L；检测快速，其中RPA扩增20 min，LFD检测10～20 min。应用该法对24个模拟样品进行检测，检测结果与RT-PCR法一致。该研究建立的LFDRPA快速检测方法操作方便简单，为ASFV现场快速检测提供了技术支持。焦健等[30]建立快速检测苹果病毒的RT-RPA方法，其以苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus）、苹果褪绿叶斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus）、苹果茎痘病毒（apple stem pitting virus）和苹果坏死花叶病毒（apple necrotic mosaic virus）为检测对象，通过设计特异性RPA引物以及探索反应最适条件，与传统RT-PCR方法比较其灵敏度、特异性，结果显示所设计的RPA引物特异性高，最适反应温度为37℃，反应时间为20 min，RT-RPA对4种苹果病毒的检测灵敏度为9.63 101copies，是传统RT-PCR的102～103倍。

4.2 RPA对细菌的检测

王素华等[31]基于炭疽杆菌BA5345基因建立了有效检测炭疽杆菌的RPA方法，在39℃水浴锅中反应30 min即可实现对目的基因片段的有效扩增，对重组质粒pUC57-BA5345的最低检测限为102copies/L，利用该研究建立的RPA方法对35份污染样品进行检测，检测的阳性率（65.71%）较常规PCR检测的阳性率（42.86%）更高。刘立兵等[32]建立了沙门氏菌的RPA检测方法。该研究选择检测的靶基因为沙门氏菌invA基因，设计特异性引物，反应温度为38℃，在水浴锅中反应20 min即可完成检验。此方法操作简便，特异性高，灵敏性可达到1.1 10-3ng/L。刘昂[33]等依据之前测序鉴定的羊源多杀性巴氏杆菌KMT1基因序列构建了pET-28a(+)-KTM1标准质粒，设计适用于RT-RPA技术的特异性引物及荧光探针，建立RT-RPA方法的最适反应体系，结果显示，该试验建立的RTRPA方法最适反应温度为39℃，最佳引物为KMT1-Fe1，灵敏度达100 kb/L，检测下限为10 kb/L，与大肠杆菌（Escherchia.coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副 伤 寒 沙 门 氏 菌（Salmonella paratyphi）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）、布鲁氏菌S2株（Brucella S2 strain）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）均无交叉反应。对13个组织样本进行检测，阳性率为76.9%，与RT-PCR检测结果的符合率达92.3%。综上所述，该实验建立的羊源多杀性巴氏杆菌RT-RPA方法具有特异性强、灵敏性高、安全可靠和快捷等特点，可用于临床诊断多杀性巴氏杆菌。

4.3 RPA对寄生虫的检测

王盛琳等[34]基于RPA技术，建立出一种可在等温环境下检测日本血吸虫核酸的方法，该方法敏感性强、特异性高、简便且快速。该研究以Sj28S基因片段为靶序列，在39℃条件下，20 min即可完成对目的基因的扩增。该方法与曼氏血吸虫、埃及血吸虫、单尾尾蚴感染钉螺、华支睾吸虫、大片形吸虫、卫氏并殖吸虫和牛带绦虫及阴性钉螺基因组DNA均无交叉反应，具有良好的特异性。敏感性试验结果显示，所建方法最低可检出100 fg/L的日本血吸虫成虫基因组DNA，或者是100 copies/L的目的基因。Li等[35]建立了一种检测旋毛虫（Trichinella.）的LF-RPA方法，该LFRPA方法可检测100 fg DNA，而传统PCR方法只能检测到1 pg DNA，LF-RPA检测灵敏度约为传统PCR方法的10倍。在对实验感染旋毛虫组和对照组小鼠的舌组织样品、膈膜组织样品和腹肌组织样品的检测中，LF-RPA法和传统PCR法均可检测到感染，实验感染小鼠的组织，对照组中都未出现假阳性。Yuan等[36]通过建立LF-RPA方法检测爪哇根结线虫（Meloidogynejavanica），该方法检测限为1 pg纯化基因组DNA，或0.01个雌成虫，或0.1个第2期幼虫，灵敏度明显高于传统的检测方法。检测16个土壤样品，用直接从土壤中提取的DNA进行LF-RPA检测，10个人工接种的爪哇根结线虫样品中只有3个样品检测为阳性，而用改进的Baermann漏斗法从土壤样品中分离的线虫gDNA，所有人工接种的爪哇根结线虫样品均被检测为阳性；所有不含根结线虫的土壤和人工接种南方根结线虫的土壤样本均未检测到阳性。Xing等[37]建立了基于高重复反转录转座SjR2基因的检测日本血吸虫（Schistosoma japonicum）的RPA方法，RPA方法的检测限为0.9 fg，与实时PCR相当。用RPA方法对30份感染粪便标本和30份未感染粪便标本进行分析，其结果与改良加藤氏厚涂片法结果一致，敏感性和特异性均为100%。在对200名居民的粪便标本检测中，使用毛蚴孵化试验被确认为阳性61人（31.5%），其中包括使用改良加藤氏厚涂片法检测为阳性的48人（24%），随后，将这200份粪便标本分别进行RPA、酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接血凝试验（IHA），结果显示，RPA检测出了阳性患者66名，其中包括5名假阳性，阴性患者134名；ELISA检出阳性患者72名，其中假阳性患者23名，阴性患者128名，其中假阴性患者12名；IHA检出阳性患61名，其中假阳性患者9名，阴性患者139名，其中假阴性患者9名。ELISA和IHA的灵敏度和特异度分别为85.2%和93.5%，80.3%和83.4%，RPA的灵敏度和特异度为100%和96.4%，该RPA方法较好地改善了现有检测技术对低负荷感染不敏感的问题。Kate等[38]对比建立了基于曼氏血吸虫（S.mansoni）ITS基因和28SrDNA基因的LF-RPA方法，基于28S基因的LF-RPA方法有着更好的特异性和敏感性，其检测灵敏度限为10 pg DNA。

5 前景展望

RPA作为在恒定温度条件下反应的新型核酸体外扩增技术，具有耗时短、灵敏度高、特异性强及操作简单等独特的优越性，引起了科研人员的大量关注[39]。但重组酶聚合酶扩增技术作为一种新兴起的等温检测技术，仍存在着一些缺点和不足，需进一步完善。尽管RPA存在一些不足，但随着科学家们RPA技术的不断应用和探索，将会改善这些不足，引起一场核酸检测的革命，使RPA技术在不同领域尤其病原现场检测中发挥更多的作用。