骨髓间充质干细胞来源外泌体通过PI3K/Akt途径减轻过氧化氢诱导心肌细胞损伤

叶莎 杨翠玲 郑媛媛

(西安交通大学第二附属医院老年心血管科，陕西 西安 710000)

心肌细胞氧化应激损伤是心肌梗死以及心肌缺血再灌注等病理生理过程中心肌细胞损伤的重要机制，抗氧化也是目前受到广泛认可的心肌梗死防治靶点[1-2]。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是来源于骨髓和脂肪等组织的多能干细胞，具有自我更新及多向分化的潜能，在组织工程技术中被用作种子细胞。在心肌梗死、脑梗死和脑外伤等疾病中，MSC能起到损伤修复作用，且这一作用与MSC来源的外泌体密切相关[3-5]。一项MSC相关的动物实验[6]证实，MSC来源的外泌体在大鼠心肌组织缺血再灌注损伤过程中起保护作用，并且这一保护作用与激活PI3K/Akt途径有关。但MSC来源外泌体是否直接减轻心肌细胞的损伤尚缺乏细胞水平的实验证据。因此，本研究在过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)诱导心肌细胞氧化应激损伤模型中分析骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC)来源外泌体通过PI3K/Akt途径的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物

成年雄性SD大鼠，体重180～200 g，8～10周龄，购自上海杰思捷实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2018-0004。

1.2 细胞

心肌H9c2细胞购自ATCC公司(美国)。

1.3 试剂与仪器

外泌体快速提取试剂盒(武汉艾美捷科技公司)，H2O2和PI3K抑制剂LY294002购自Sigma公司(美国)，其中LY294002用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，储存液浓度为10 mmol/L；细胞存活检测试剂盒(MTS法)购自Promega公司(丹麦)，细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL法)购自碧云天公司(中国)，Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、p-PI3K以及p-Akt的一抗购自Santa Cruz公司(美国)。细胞培养箱为Thermo公司(美国)，凝胶电泳及成像仪器均为天能公司(中国)。外泌体提取试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.4 BMMSC的培养及外泌体的提取

断头法处死SD大鼠，局部碘伏消毒后取出股骨和胫骨，剪断两端的骨骺端，显露骨髓腔，用培养基反复冲洗骨髓腔，得到的冲洗液在离心机中于4 ℃、2 000 g离心5 min，保留沉淀用含10%胎牛血清的培养基重新悬浮，贴壁培养、定期换液及传代培养，取第三代BMMSC，采用流式细胞术进行干细胞特性鉴定，分别对干细胞标志物CD29和CD105进行检测，阳性率均为99%以上。采用外泌体提取试剂盒提取第三代BMMSC内的外泌体备用。

1.5 H9c2细胞培养及分组

H9c2细胞在含有10%胎牛血清的培养基中贴壁培养，常规消化传代后进行分组。为验证外泌体的保护作用，细胞被分为对照组、H2O2组和H2O2+外泌体组，参照陈睿等[7]的研究确定外泌体的浓度为2 μg/mL，分别用不含药物的培养基、含有0.5 mmol/L H2O2的培养基、含有0.5 mmol/L H2O2+2 μg/mL外泌体的培养基进行处理，作用24 h后收集细胞进行检测。为验证PI3K/Akt通路在外泌体减轻心肌细胞损伤中的作用，细胞被分为溶剂对照组、溶剂对照+H2O2组、溶剂对照+H2O2+外泌体组和LY294002+H2O2+外泌体组，分别用含有0.1% DMSO的培养基、含有0.1% DMSO+0.5 mmol/L H2O2的培养基、含有0.1% DMSO+0.5 mmol/L H2O2+2 μg/mL外泌体的培养基以及含有10 μmol/L LY294002+0.5 mmol/L H2O2+2 μg/mL外泌体的培养基进行处理。

1.6 细胞存活率的检测

采用MTS法检测各组细胞的存活率，按照试剂盒说明书进行操作后在酶标仪上设置波长为490 nm以及检测吸光值A490，按照公式[(实验孔A490-空白孔A490)/(对照孔A490-空白孔A490)×100%]计算细胞的存活率。

1.7 细胞凋亡率的检测

采用TUNEL法检测各组细胞的凋亡率，按照试剂盒说明书进行操作后在显微镜下随机观察3个视野，对TUNEL阳性的细胞以及DAPI阳性的细胞进行计数，按照(TUNEL阳性细胞数/DAPI阳性细胞数)×100%计算细胞凋亡率。

1.8 蛋白表达的检测

采用蛋白裂解液提取各组细胞中的蛋白，采用免疫印迹检测蛋白表达水平。首先在SDS-聚丙烯酰胺凝胶内进行电泳，分离不同分子量的蛋白后电转移至硝酸纤维素膜，而后孵育Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、p-PI3K、p-Akt以及β-actin的一抗过夜(24 h)，次日孵育二抗1 h。最后在凝胶成像系统内对蛋白表达水平进行定量分析。

1.9 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计学处理，实验数据均为计量资料，以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，有统计学差异的资料进一步进行LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMMSC来源外泌体对H2O2刺激H9c2细胞存活率及凋亡率的影响

与对照组比较，H2O2组H9c2细胞的存活率明显降低，凋亡率明显增加(P<0.05)；与H2O2组比较，H2O2+外泌体组H9c2细胞的存活率明显增加，凋亡率明显降低(P<0.05)(表1)。

表1 三组H9c2细胞存活率及凋亡率的比较

2.2 BMMSC来源外泌体对H2O2刺激H9c2细胞中凋亡基因表达的影响

与对照组比较，H2O2组H9c2细胞中Bcl-2的表达水平明显降低，Bax和cleaved caspase-3的表达水平明显增加(P<0.05)；与H2O2组比较，H2O2+外泌体组H9c2细胞中Bcl-2的表达水平明显增加，Bax和cleaved caspase-3的表达水平明显降低(P<0.05)(图1)。

注：与对照组比较，*表示P<0.05；与H2O2组比较，#表示P<0.05。

2.3 BMMSC来源外泌体对H2O2刺激H9c2细胞中PI3K/Akt通路的影响

与对照组比较，H2O2组H9c2细胞中p-PI3K和p-Akt的表达水平明显降低(P<0.05)；与H2O2组比较，H2O2+外泌体组H9c2细胞中p-PI3K和p-Akt的表达水平明显增加(P<0.05)(图2)。

注：与对照组比较，*表示P<0.05；与H2O2组比较，#表示P<0.05。

2.4 PI3K抑制剂对BMMSC来源外泌体调节H2O2刺激H9c2细胞存活率及凋亡率的影响

与溶剂对照组比较，溶剂对照+H2O2组H9c2细胞的存活率明显降低，凋亡率明显增加(P<0.05)；与溶剂对照+H2O2组比较，溶剂对照+H2O2+外泌体组H9c2细胞的存活率明显增加，凋亡率明显降低(P<0.05)；与溶剂对照+H2O2+外泌体组比较，LY294002+H2O2+外泌体组H9c2细胞的存活率明显降低，凋亡率明显增加(P<0.05)(见表2)。

表2 四组H9c2细胞存活率及凋亡率的比较

2.5 PI3K抑制剂对BMMSC来源外泌体调节H2O2刺激H9c2细胞凋亡基因表达水平的影响

与溶剂对照组比较，溶剂对照+H2O2组H9c2细胞中Bcl-2的表达水平明显降低，Bax和cleaved caspase-3的表达水平明显增加(P<0.05)；与溶剂对照+H2O2组比较，溶剂对照+H2O2+外泌体组H9c2细胞中Bcl-2的表达水平明显增加，Bax和cleaved caspase-3的表达水平明显降低(P<0.05)；与溶剂对照+H2O2+外泌体组比较，LY294002+H2O2+外泌体组H9c2细胞中Bcl-2的表达水平明显降低，Bax、cleaved caspase-3的表达水平明显增加(P<0.05)(图3)。建议增加检测总Akt、PI3K及p-Akt和p-PI3K水平。

注：与溶剂对照组比较，*表示P<0.05；与溶剂对照+H2O2组比较，#表示P<0.05；与溶剂对照+H2O2+外泌体组比较，&表示P<0.05。

3 讨论

近年，随着组织工程技术的不断发展，MSC在组织及细胞损伤中的修复及保护作用受到越来越多的关注。在心肌梗死的发病和治疗过程中，虽然介入治疗能使心肌获得血流再灌注，但在获得再灌注前部分心肌细胞已发生了不可逆损伤，另有部分心肌细胞在经历缺血再灌注后会出现损伤加重。氧化应激是与心肌细胞缺血缺氧损伤和缺血再灌注损伤均密切相关的生物学环节，减轻心肌细胞的氧化应激损伤成为了备受关注的心肌梗死治疗靶点[8]。

MSC的组织及细胞保护作用与其释放的外泌体密切相关[9]，心肌损伤相关的细胞实验证实，MSC来源的外泌体对阿霉素诱导的心肌细胞损伤具有保护作用[7]。肺上皮细胞氧化应激损伤相关的实验证实，MSC来源的外泌体能减轻H2O2诱导的肺上皮细胞损伤[10]。在心肌细胞损伤和肺上皮细胞损伤中，MSC来源的外泌体均可促进细胞存活，抑制细胞凋亡[9-10]。本研究将BMMSC来源的外泌体用于H2O2诱导心肌细胞损伤的干预。在H2O2诱导下，心肌H9c2细胞的存活率降低，凋亡率增加；BMMSC来源的外泌体干预后，细胞的存活率增加，凋亡率降低，表明BMMSC来源的外泌体在H2O2诱导心肌细胞损伤的过程中起保护作用，且这一保护作用与其抗凋亡效应有关。

在氧化应激诱导细胞损伤及凋亡的过程中，线粒体凋亡途径的过度激活起关键作用。Bcl-2和Bax是一对调控线粒体途径凋亡的分子，前者抑制线粒体内细胞色素C的释放，后者促进线粒体内细胞色素C的释放；从线粒体内释放进入细胞浆的细胞色素C能启动级联放大反应，最终通过增加cleaved caspase-3的表达引起细胞凋亡[11-12]。多项研究[13-14]已证实在梗死的心肌组织及缺血缺氧的心肌细胞中Bcl-2的表达降低，Bax和cleaved caspase-3的表达增加，本研究也证实H2O2诱导H9c2细胞损伤过程中上述凋亡分子的表达也发生了相同的变化。BMMSC来源的外泌体干预后，细胞中Bcl-2的表达增加，Bax和cleaved caspase-3的表达降低，表明BMMSC来源的外泌体在H2O2诱导心肌细胞损伤的过程中可发挥抑制线粒体途径凋亡的功能，与其降低细胞凋亡率的结果吻合。

PI3K/Akt途径是调控线粒体途径凋亡的重要信号转导途径之一，该途径的激活显著抑制细胞凋亡[15-16]。在MSC来源的外泌体减轻心肌缺血再灌注损伤的过程中，其心肌组织的保护作用与激活PI3K/Akt通路有关[6，17]。本研究证实，在H2O2诱导H9c2细胞损伤过程中，PI3K/Akt途径受到抑制，BMMSC来源的外泌体干预后细胞中p-PI3K和p-Akt的表达增加，PI3K/Akt途径显著激活，表明BMMSC来源的外泌体减轻H2O2诱导H9c2细胞损伤的作用可能与激活PI3K/Akt途径有关。为了进一步阐明这一机制，本研究在外泌体干预的同时加用PI3K抑制剂LY294002，结果显示该抑制剂可逆转外泌体增加引起的一系列变化，导致细胞存活率及Bcl-2表达降低，细胞凋亡率以及Bax和cleaved caspase-3表达增加，表明BMMSC来源外泌体减轻H2O2诱导H9c2细胞损伤的作用部分与激活PI3K/Akt途径有关。

综上所述，BMMSC来源的外泌体能减轻H2O2诱导H9c2细胞损伤，外泌体的这一保护作用与激活PI3K/Akt途径以及抑制线粒体途径细胞凋亡有关。