60Co-γ辐照对葡萄3种病原真菌的抑制效果

王辰元，王 钒，徐 静，李文静，张秉乾，冉隆贤，b，甄志先，b

（河北农业大学 a.林学院；b.河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000）

葡萄嫩枝扦插是一种以夏季修剪下来的半木质化的葡萄新梢为扦插材料进行扦插繁殖的重要育苗方法，利用夏季枝量大、气温高、生长快的有利条件，可以达到废物利用、快速育苗的目的[1]。采用这一技术繁育苗木，成本低廉，操作简单，扦插成活率高，繁育速度快，能满足生产中对苗木的大量需求，可为葡萄高产提供有力的保障[2]。但是，长期采用扦插繁殖的方法，容易造成病原菌随着繁殖材料而迁移和扩散等问题，特别是在利于病害发生的环境条件和管理水平低下的情况下，会很快导致病害的发生，造成重大损失。目前，生产中主要使用化学药剂对葡萄苗木、种条进行消毒处理，然而化学药剂的长期使用，不仅会使植物产生抗药性，更会导致环境的污染。采摘后的新鲜水果会遭到一些包括真菌及细菌在内的有害生物的危害，而葡萄鲜品上市期比较短，且葡萄的贮藏技术还不太成熟，葡萄的病害直接影响其品质和保鲜，故研究葡萄采摘后病害的种类及其防治方法，是葡萄保鲜贮藏、上架销售、长途运输中亟待解决的重要问题[3-4]。因此，为了减少化学药剂的使用，保证扦插繁殖成活率，提高葡萄果实的防霉保鲜效果，需要探索安全高效的除害技术。

辐照技术已被应用于多个领域中，且产生了巨大效益，不仅能够灭除病原菌和害虫，还具有无化学残留、全程无热源和无添加剂的优点，并能快速地进行渗透性消毒。其中的60Co-γ 辐照技术在农业生产中主要应用于种子和枝条诱变、水果保鲜和粮食贮藏防虫等方面[5-9]。赵艺璇等[10]对大花秋葵和锦葵的种子进行辐照处理，结果证明，辐照能促进种子萌发，同时能增强植物的抗逆性；陈春霞等[11]、何平等[12]、叶开玉等[13]采用γ 射线进行辐照处理，结果都获得了表现优良的变异品种[11-13]。60Co-γ 辐照还是防治虫害的有效手段，通过辐照谷类及其制品可以杀死害虫及虫卵或致其不育，因此，辐照可以解决因贮藏环境不适宜而导致的粮食虫害问题。辐照也是果实保鲜的措施之一，低剂量的辐照能提高植物体内超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低其丙二醛（MDA）含量，有利于植物的正常生长代谢[14]。石彬等[15]、杨俊丽等[16]分别用低剂量的60Co-γ 辐照猕猴桃、草莓，均能延长果实的贮藏期，且对果实品质的影响都较小。王秋芳等[17]的研究结果表明，1 000 Gy剂量以下的电子束辐照对巨峰葡萄的品质无影响，剂量为700 Gy 的辐照可以使葡萄果实在贮藏初期的抗氧化能力增强，从而能延缓果实的衰老。关文强等[18]、Witbooi 等[19]、康芬芬等[20]采用60Co-γ辐照对葡萄进行保鲜处理，但他们在所用辐照的剂量和试验结果方面均存在较大差异，因此，辐照技术对于葡萄主要病原真菌的抑制效果仍需深入研究。为此，本研究分别以巨峰葡萄1年生嫩枝和果实为试材，采用不同剂量的60Co-γ 辐照处理进行试验，分析了60Co-γ 辐照处理对葡萄嫩枝和果实上主要病原真菌的抑制作用，旨在探寻一种新的除菌方法，从而为辐照除菌技术的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的植物材料为巨峰葡萄1年生嫩枝和果实，均采自河北省保定市满城区南辛庄村葡萄园。

供试的菌种分别为葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea、葡萄溃疡病菌Botryosphaeriasp.和葡萄白腐病菌Coniella diplodiella，试验所用菌种均由中国农业科学院植物保护研究所提供。

试验所用60Co-γ 辐照的钴源由北京大学技物楼钴源实验室提供，钴源的辐照剂量率为30 Gy/min。

1.2 试验方法

1.2.1 辐照处理对葡萄3 种病原真菌的影响试验

辐照对病原真菌孢子萌发的影响试验：配制浓度为105个/mL 的葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌和葡萄溃疡病菌孢子悬浮液，置于无菌离心管中，进行剂量分别为40、100、600、1 000、2 000 Gy的60Co-γ 辐照，每个菌株的辐照各设3 次重复，以不进行辐照的为对照。辐照后用移液枪吸取100 μL的孢子悬浮液均匀地涂布于PDA 平板上，于25 ℃的培养箱中培养10 h，在显微镜下观察计数，并计算分生孢子萌发率。

辐照对病原菌菌丝生长的影响试验：将葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌和葡萄溃疡病菌分别接种至PDA 平板上，于25 ℃的温度条件下培养5 d 后进行60Co-γ 辐照，辐照剂量分别设为40、100、600、1 000、2 000 Gy，每个菌株的辐照各设3 次重复，以不进行辐照的为对照。将辐照过的菌株，取同样大小的菌饼接种至新的PDA 平板上，在25 ℃的培养箱中继续培养5 d，观察并记录其生长直径。

1.2.2 辐照处理对葡萄嫩枝扦插成活率的影响试验

从田间采取健康的1年生葡萄嫩枝，去除顶端部分，保留1 ～2 片半叶，上切口距离第1个芽的上方1 cm 左右平剪并封蜡，下切口在尽量靠近叶柄基部斜切，制成长度为10 ～15 cm 的插条。将处理好的枝条置于剂量分别为40、100、600 Gy 的60Co-γ 射线下辐照，每个处理各设3 次重复，每次重复各处理15个枝条，以未作辐照的枝条为对照。将辐照过的枝条浸泡于生根粉溶液后扦插，保持适宜的温度、湿度和光照，观察并记录枝条成活情况，以确定60Co-γ 辐照葡萄嫩枝的适宜强度与时间。

1.2.3 辐照处理对葡萄嫩枝上病原真菌的抑制作用的观测

选择长势一致、健壮的葡萄绿枝条，剪去枝条上的叶片，修剪成10 ～15 cm 的小段，枝条剪口以石蜡封固。用75%的酒精对枝条表面进行消毒后再用无菌水冲洗干净，然后在葡萄枝条中部进行刺伤处理，使用打孔器在葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌和葡萄溃疡病菌的PDA 平板上打取菌饼，将其接种于枝条刺伤部位，以空白菌饼为对照，用保鲜膜包扎好，然后进行保湿培养，培养第7 天将发病枝条置于剂量分别为40、100、600 Gy的60Co-γ 射线下辐照，以不作辐照的为对照，每个处理各辐照10个枝条，继续培养5 d 后记录病斑直径，计算病斑面积。

1.2.4 辐照处理对葡萄果实病原真菌的抑制作用的观测

选取成熟度一致、大小均匀、无病虫危害的葡萄果实，经75%的酒精消毒后再用无菌水冲洗干净。使用灭菌接种针在果实表面等距离地扎3个小孔，再用移液枪吸取浓度为105个/mL 的葡萄灰霉病菌和葡萄白腐病菌的孢子悬浮液接种在伤口上[21]，每种孢子悬浮液各20 μL，于25 ℃的温度条件下培养20 h，待病菌萌发侵入后才进行60Co-γ辐照，其剂量分别设为100、600、1 000 Gy，以接种病菌但未进行60Co-γ 辐照的果实为对照，每个处理各用果实10个，重复3 次。辐照后仍然将其放在25 ℃的培养箱中继续培养，观察并记录各处理下果实的发病情况。

1.3 统计方法

使用Microsoft Excel（Office 2010）软件整理原始数据、绘制表格；使用SPSS 21.0 软件进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 辐照处理对葡萄3 种病原真菌的影响

2.1.1 辐照处理对病原真菌孢子萌发的影响

不同剂量的60Co-γ 辐照处理对病原真菌孢子萌发的影响情况如图1所示。由图1 可知，当辐照剂量大于600 Gy 时，3 种病原真菌孢子的萌发均受到显著的抑制；其中，60Co-γ 辐照处理对葡萄灰霉病菌的孢子具有明显的致死作用。以剂量分别为40 和100 Gy 的60Co-γ 辐照处理后，葡萄灰霉病病菌孢子的萌发率与对照处理的无显著性差异；剂量为600 Gy 的辐照处理可抑制葡萄灰霉病菌94.0% 的孢子的萌发；以剂量在1 000 Gy 及以上的辐照处理后，葡萄灰霉病病菌孢子萌发率最低，仅为0.7%。

图1 不同剂量的60Co-γ 辐照处理对葡萄3 种病原真菌孢子萌发的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of 60Co-γ radiation at different doses on spore germination of three grape pathogenic fungi

以低剂量（40 和100 Gy）的60Co-γ 射线辐照葡萄白腐病菌和葡萄溃疡病病菌孢子悬浮液后，其孢子萌发率与对照处理的均无显著性差异；当辐照剂量高于600 Gy 时，此两种病菌孢子的萌发率均开始显著下降；在剂量为2 000 Gy 的辐照处理下，葡萄白腐病菌孢子的萌发率最低（仅为1.9%），其抑制率高达97.4%，而葡萄溃疡病病菌孢子的萌发率也是最低（为5.9%）的，其抑制率为92.5%。

2.1.2 辐照处理对病原真菌菌丝生长的影响

不同剂量的60Co-γ 辐照处理对3 种病原真菌菌丝生长的影响情况见表1。表1 表明，不同剂量的60Co-γ 辐照处理对不同病菌生长的抑制作用有所不同，低剂量（40 Gy）的辐照处理对葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌和葡萄溃疡病菌的菌丝均有一定的刺激与促进生长的作用，当剂量达到一定强度时，60Co-γ 辐照处理对病菌菌丝的生长才有抑制作用。其中，葡萄溃疡病菌对60Co-γ 的辐照处理最敏感，剂量为100 Gy 的60Co-γ 辐照处理对其就有显著的抑制作用，而剂量在1 000 Gy 以上的60Co-γ 辐照处理对葡萄灰霉病菌丝才有抑制作用，剂量为2 000 Gy 的60Co-γ 辐照处理可使得葡萄灰霉病菌、葡萄溃疡病病菌都不能生长，葡萄灰霉病菌菌丝体由白色变成黄褐色，接种至新的培养基上其不能继续生长，该剂量对葡萄白腐病菌菌丝有显著的抑制作用，却没有杀灭的效果。

表1 不同剂量的60Co-γ 辐照处理对3 种病原真菌菌丝生长的影响†Table 1 Inhibition effects of different doses of 60Co-γ on mycelial growth of three fungal pathogens

2.2 辐照处理对嫩枝扦插成活率的影响

不同剂量的60Co-γ 辐照处理对葡萄嫩枝扦插成活率的影响情况如图2所示。由图2 可知，不同剂量的60Co-γ 辐照处理的葡萄枝条成活率不同。随着辐照剂量的加大，其成活率先上升后降低，当辐照剂量为100 Gy 时，葡萄枝条的成活率达到了最大值，为48.9%；剂量为600 Gy 的辐照处理对枝条成活有一定的抑制作用，但该处理的成活率与对照处理的无显著性差异。

图2 不同剂量的60Co-γ 辐照处理对葡萄嫩枝扦插成活率的影响Fig.2 Survival rates of grape cuttings after 60Co-γ radiation at different doses

2.3 辐照处理对葡萄嫩枝真菌病害的抑制效果

对发病嫩枝进行不同剂量的60Co-γ 辐照处理后统计其病斑扩展面积，结果如图3所示。由图3A 可知，低剂量（40 Gy）的辐照处理对葡萄灰霉病病斑扩展的抑制作用不明显，剂量分别为100和600 Gy 的60Co-γ 辐照处理下葡萄灰霉病病斑的扩展面积与对照处理的相比均有显著性差异；葡萄白腐病病斑扩展面积与辐照剂量呈负相关关系，即随着辐照剂量的加大病斑扩展面积逐渐减小，剂量分别为100 和600 Gy 的60Co-γ 辐照处理对葡萄白腐病病斑扩展均有显著的抑制作用，而低剂量（40 Gy）的辐照处理对其抑制作用不明显（图3B）；由图3C 可知，剂量为40 Gy 及以上的辐照处理对葡萄溃疡病病斑的抑制效果均显著。

图3 不同剂量的60Co-γ 辐照对葡萄嫩枝病斑扩展的抑制效果Fig.3 Inhibitory effects of 60Co-γ radiation at different doses on lesion expansion of grape cuttings

2.4 辐照处理对葡萄果实真菌病害的抑制作用

不同剂量的60Co-γ 辐照处理对葡萄果实真菌病害的影响情况如图4所示。由图4A 可知，辐照处理2 d 后，各处理组果实的葡萄灰霉病发病率均显著低于对照处理的，其中，剂量分别为600 与1 000 Gy 的辐照处理的效果均较好，果实的葡萄灰霉病发病率分别仅有10.0%和3.3%；辐照处理4 和6 d 后，剂量分别为600 与1 000 Gy 的辐照处理组果实的葡萄灰霉病发病率均显著低于对照组的，以剂量为100 Gy 的辐照处理6 d 后果实的葡萄灰霉病发病率与对照组的无显著差异；辐照处理8 d 后，果实的葡萄灰霉病发病率持续增加，剂量为600 Gy 的辐照处理果实的葡萄灰霉病发病率与对照组的无显著差异；辐照处理10 d 后，虽然1 000 Gy的辐照处理组与对照组之间仍有显著差异，但葡萄果实几乎全部发病。因此，60Co-γ 辐照处理果实只能使葡萄灰霉病的发生时间延后4 ～6 d，仍不能完全控制葡萄果实灰霉病的发生。

由图4B 可知，剂量为100 Gy 的辐照处理对葡萄果实白腐病的抑制效果不明显，葡萄果实白腐病的发病率虽略低于对照组的，但其差异没有达到显著水平；剂量分别为600 与1 000 Gy 的辐照处理组果实的葡萄白腐病发病率，辐照处理2 d后的均显著低于对照组的，而辐照处理4 d 后的发病率与对照组的无显著差异，其中剂量为1 000 Gy的辐照处理对葡萄果实的白腐病的抑制效果最好，辐照处理2 d 后白腐病的发病率为60.0%。因此，一旦葡萄白腐病菌大量侵入伤口，60Co-γ 辐照处理也不能有效阻止病菌在葡萄果实组织中扩展，但可以推迟葡萄果实白腐病在贮藏期间的发病时间。

图4 不同剂量的60Co-γ 辐照对葡萄果实病原真菌的抑制效果Fig.4 Inhibition effects on fungal pathogens of grape after 60Co-γ radiation at different doses

3 讨论与结论

60Co-γ 辐照处理对葡萄3 种真菌病害病原菌的孢子和菌丝都有明显的抑制甚至致死作用。辐照其孢子时，剂量大于600 Gy 的辐照处理开始有明显的抑制效果，并且随着辐照剂量的加大其对孢子萌发的抑制效果越明显；当辐照剂量为2 000 Gy时，3 种病菌的孢子几乎都未萌发。辐照其菌丝体时，对60Co-γ 辐照处理的敏感性，菌丝比孢子低；2 000 Gy 的辐照剂量可以阻止葡萄灰霉病菌和葡萄溃疡病菌的生长，该剂量对葡萄白腐病菌的菌丝虽有显著的抑制作用，却没有杀灭的效果，对葡萄白腐病菌菌丝的抑制可能需要更大剂量的60Co-γ 辐照。

在以60Co-γ 辐照处理抑制葡萄嫩枝3 种真菌病害的试验中发现，最佳辐照剂量为600 Gy。经60Co-γ 辐照处理后，葡萄嫩枝上3 种病害病斑的扩展面积均小于对照组的，不同剂量的60Co-γ 辐照处理对葡萄灰霉病、葡萄白腐病和葡萄溃疡病这3 种病菌的病斑在葡萄嫩枝上的扩展均有一定的抑制作用，而且随着辐照剂量的加大，病斑的扩展面积显著减小，其中剂量在100 Gy 以上的辐照处理对3 种病菌的抑制作用均显著，而以剂量为600 Gy的60Co-γ 辐照处理后病斑扩展的面积最小，说明其抑制效果最好，剂量为600 Gy 的辐照处理对葡萄灰霉病、葡萄白腐病、葡萄溃疡病的抑制率分别为84.5%、75.9%、76.9%，与对照组的相比，剂量为600 Gy 的辐照处理对葡萄嫩枝的成活率无影响。因此建议，嫩枝扦插繁殖时宜采用剂量为600 Gy 的60Co-γ 辐照处理以替代传统的化学药剂杀菌方式，从而减少化学药剂的使用量。

通过在葡萄果实上刺伤接种葡萄灰霉病菌和葡萄白腐病菌，模拟在运输过程中有挤压裂果的情况下病菌对果实的侵染状况，经过60Co-γ 辐照处理后，在处理前期辐照能明显地抑制葡萄灰霉病和葡萄白腐病的发生，表明60Co-γ 辐照处理可使葡萄果实在贮藏期间病害发生的时间推迟，从而达到延长葡萄果实货架期的目的。Witbooi 等[19]的研究结果表明，当剂量在900 Gy 及以下时，辐照处理对葡萄品质不会产生不良影响。但是，目前国内尚未有关于60Co-γ 辐照处理对巨峰葡萄品质影响的研究报道，因此，采用剂量为600 Gy 的辐照处理是否能真正预防葡萄果实贮藏期病害的发生，对此尚待进一步研究。

60Co-γ 射线能量大，其灭菌效果比采用蒸汽灭菌等普通灭菌方法的灭菌效果更好，其灭菌更彻底。目前，有关60Co-γ 辐照葡萄枝条的研究主要集中在探讨其诱变及性状变异等方面，有关60Co-γ辐照处理对枝条萌芽率、物候期及新梢生长的影响的研究也有报道，而有关60Co-γ 辐照处理对其病害抑制作用的研究却鲜见报道[22]。同时，葡萄保鲜技术中的冷藏和气调保鲜也都有抑制采后病原菌的作用，这些技术各具特点，也都有局限性，只有配合使用辐照保鲜技术与其他保鲜技术，才可产生良好作用，降低辐照剂量，减少辐照成本，提高保鲜效果，促进水果辐照保鲜技术的商业化应用[23-24]。

本研究结果表明，以剂量为600 Gy 的60Co-γ辐照葡萄嫩枝，能显著抑制其病斑的扩展，且对其嫩枝扦插成活率也无明显的不良影响。此剂量亦能有效抑制其枝条上携带的病菌孢子的萌发和菌丝的生长。60Co-γ 辐照葡萄果实的适宜剂量为600 Gy，此剂量的辐照处理可使葡萄果实贮藏期病害发生的时间推迟4 ～6 d。但是，目前该辐照技术仍局限于实验室的研究中，还没有大面积地应用到生产中，而且，60Co-γ 辐照处理对巨峰葡萄品质的影响情况尚不清楚，因此，今后仍需在此剂量的基础上进行深入的研究，最终达到在不影响植株正常生长和果实品质的前提下最大限度地抑制甚至杀死病原真菌的目的。