锥栗农家品种栗疫病抗性及果实表型性状的变异分析与联合选择

叶树涛，顾光仕，李 煜，方 周，张 晶，杨金辉，郑国华，陈 辉

（福建农林大学 a.林学院；b.经济林研究所；c.园艺学院，福建 福州 350002）

锥栗Castanea henryi为壳斗科栗属高大落叶乔木，雌雄异花同株，主要栽培于福建省北部和浙江省南部地区，是我国南方重要的木本粮食树种。锥栗果实糯甜，富含淀粉、可溶性蛋白、蔗糖、可溶性糖等多种营养成分，同时含有17 种氨基酸，其中包括7 种人体必需氨基酸[1-3]，长期食用锥栗对于高血压和心血管疾病的预防大有裨益[4]。

栗疫病是一种由栗属树种感染栗疫菌Cryphonectria parasitica后引起的真菌性病害[5]。栗疫菌危害的主要部位为树干和主枝，当栗属树种被栗疫菌侵染后，首先其表皮形成褐色凹陷病斑，随后肿胀或纵向龟裂，病害严重发生时整株会枯死[6-8]。栗疫病对植物物种有着毁灭性的危害。20世纪初，栗疫病在美国纽约美洲栗上被发现，在随后的几十年里，此病害在北美严重发生，致使美洲栗树遭受灭顶之灾[9]；从20世纪30年代开始，栗疫病在欧洲大面积蔓延，使得欧洲栗也被严重侵害[10]。20世纪90年代初期，我国在福建锥栗林中首次调查到疑似感染栗疫病的植株，经鉴定后证实该植株的确被栗疫菌侵染[11]。目前，有关栗疫病的防治方法主要有喷施化学药物（如波尔多液和多菌灵）、物理刮除染病组织、增施有机肥以减轻感病程度、筛选低毒力菌株等种方法，但是，采用这些防治措施还不能从根本上解决问题，只有选育出抗栗疫病的新品种才能从根本上防治栗疫菌病害[12-14]。美国科学家大力开展美洲栗的抗栗疫病育种工作，将对栗疫病具有较强抗性的中国板栗引种到美国，开展杂交育种工作，目前已取得了显著成效[15]。有关板栗疫病的研究内容目前主要集中在选择育种和抗性基因定位等方面[16-17]。

锥栗作为我国特有的三大栗属树种之一，其经济价值与营养价值均极高。栗疫病的发生会使大量锥栗树减产甚至死亡，结果会造成巨大的经济损失，并带来严重的生态危害，因此，急需选育出对栗疫病具有较强抗性的新品种来应对栗疫病的危害。为给锥栗高抗病性、优质、高产良种的选育提供参考依据，以福建省建瓯市广为栽培的17个农家品种为供试材料，对其抗栗疫病性与果实表型性状的变异情况进行了调查与分析，现将研究结果分析报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

研究地位于福建省建瓯市水源乡（27°8′5″N，118°48′21″E）。供试品种为福建省建瓯市水源乡广为栽培的17个锥栗农家品种，其分别为‘处暑红’‘双峰子’‘大包榛’‘乌榛’‘大尖嘴’‘油榛’‘中尖嘴’‘黄榛’‘铁锥’‘油桐仔’‘小尖嘴’‘乌壳长芒’‘红仔榛’‘欧宁仔’‘白露仔’‘牛角仔’（晚熟）和‘牛角仔’（中熟），均为2000年以当地野生锥栗为砧木嫁接的无性系。采用完全随机区组设计，每个试验小区各种植10 株，设3 次重复，其株行距均为5 m×6 m。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分离与观察

依据栗疫病的发病特征寻找疑似感染栗疫病的植株，采集其侵染部位组织带回实验室保存。剪取长×宽为2 mm×2 mm 的病斑组织，用无菌水冲洗干净后，先将其放入70%的酒精中表面消毒30 s，再放入0.1%的升汞溶液中消毒60 s，然后用无菌水冲洗。将病斑块接种在PDA 培养基上，置于28 ℃的光照恒温培养箱中培养5 d，然后用打孔器在菌落边缘打取直径为3 mm 的菌块，将其接种在新的PDA 培养基上继续纯化，纯化2 次后便可使用。

形态学的观察：培养5 d 后观察菌落的形态，在光学显微镜下观察分生孢子器和分生孢子的形态，测量分生孢子的大小，观察菌落特征、分生孢子器的颜色和菌丝形态特征。

病原菌的序列分析：取培养2 ～3 d 的菌落边缘的菌丝，使用真菌DNA 试剂盒（OMEGA，美国）提取病原菌的DNA。

采用真菌生物通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3′）作为扩增引物。

PCR 反应体系：上游引物和下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTP 1 μL，rTaq 酶0.5 μL，ddH2O 40.5 μL，将扩增获得的PCR 产物进行DNA 测序，将获得的病原菌核糖体DNA-ITS 序列与数据库NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中公布的栗疫菌ITS 区序列进行同源性比对。

1.2.2 锥栗疫病抗性的检测

参照有关文献[18-20]中说明的方法（适当改进）对栗疫病抗性进行评价。从每个农家品种中挑选健康植株，选取其1年生枝条进行栗疫菌接种，每株植株各选取粗度一致的枝条6 根，接种前使用无菌水冲洗3 遍，用接种针在枝条表面刺出直径为3 mm 的环形伤口，伤口深至木质部。用直径为3 mm 的打孔器将培养5 d 的栗疫菌打成菌块，每根枝条接种3个菌斑，使用挑针将菌块的菌丝面与枝条的伤口接壤处贴合，然后用浸水的无菌棉包裹以保湿，最后用保鲜膜将无菌棉包裹起来，防止无菌棉脱落及外来杂菌的侵染，以接种空白培养基的为对照。从所选植株上采集长为20 cm的1年生枝条，带回实验室进行室内接种。室内接种时，将枝条用无菌水冲洗后，先放入2%的次氯酸钠溶液中浸泡10 min，再用无菌水冲洗干净自然风干。同室外接种一样，每根枝条各接种3个病斑，以接种空白培养基的为对照。室内接种时，先将枝条两端裹上浸了水的无菌棉，然后将其放入接种盘中，再将接种盘用保鲜膜包裹起来置于28 ℃的光照培养室中培养。所有的接种材料在接种7 d 后均应取下保鲜膜和无菌棉，再继续观察。

在接种的第21 天，使用游标卡尺对病斑的长和宽进行测量，以椭圆面积的计算公式计算病斑面积。枝条面积=枝条截面周长×病斑长（枝条截面周长=π×病斑处枝条直径）；染病率=病斑面积/枝条面积。依据染病率将锥栗疫病侵染程度分为5 级：1 级，染病率＜20%；2 级，20%≤染病率＜30%；3 级，30%≤染病率＜40%；4 级，40%≤染病率＜50%；5 级，染病率≥50%。根据如下公式计算锥栗疫病染病指数：染病指数=∑（代表数值×病级株数）×100/（发病最重级的代表数值×株数总和）。再依据染病指数将锥栗对疫病的抗性分为如下几个等级：免疫级（I），染病指数=0；抗病级（R），0 ＜染病指数＜35；感病级（S），35 ≤染病指数＜50；高感病级（H），染病指数≥50。

1.2.3 果实表型性状的测定

利用电子天平测量锥栗总苞质量和果质量，利用游标记卡尺测量果苞长、果苞宽、果苞高、果苞厚、果长、果宽、果高。

果实成分测定主要包括淀粉（蒽酮比色法）[21]、蔗糖（间苯二酚法）[21]、还原性糖（3,5-二硝基水杨酸法）[21]、可溶性糖（蒽酮比色法）[22]、可溶性蛋白（考马斯亮蓝G-250 染色法）[22]。

1.2.4 染病率和果实表型性状的统计分析

利用Excel 和SPSS 软件对栗疫病染病率和果实表型性状分别进行变异分析、方差分析、相关性分析、聚类分析，对栗疫病染病率和果实表型性状指标测定值进行标准化处理，将室内室外接种枝条的栗疫病染病率及其标准化值进行平均化处理，取染病率的负数值为抗病性数值，将果实表型性状指标测定值平均化处理后获取标准化值，对所有标准化值进行累加并排序，选择出表现优良的农家品种。变异系数、重复力、标准化值的计算公式分别如下：

式（1）～（3）中：CV为变异系数，S为标准差，M为平均值；R为重复力，F为检验值；Zx为标准化值，X为原始值，为总平均值，XS为总平均标准差。

2 结果与分析

2.1 病原菌的鉴定

2.1.1 病原菌的形态学观察

采集疑似栗疫病的病原菌，经分离、纯化、培养得到菌株ZLYB。培养3 d 后观察到的病原菌菌落形态如图1所示。从图1 中可以看出，菌落呈近圆形，菌丝为乳白色，菌落中心为橘黄色，边缘菌丝为白色。在电子显微镜下观察到的病原菌子实体如图2所示。从图2 中可以看出，病原菌的主要特征为：子座大小约0.2 mm，颜色为橘黄色。

图1 病原菌菌落Fig.1 Colony of pathogenic bacteria

图2 病原菌子实体Fig.2 Fruiting bodies of pathogens

2.1.2 病原菌核糖体DNA-ITS 序列的比对

将病原菌的序列导入数据库NCBI 中进行比对，获得其与63 条C.parasitica序列相似度的均值为86.90%；其中，病原菌与C.parasiticaKC844302.1 的相似度最高，为89.76%。依据病原菌的形态学观察结果及病原菌DNA 比对结果，确定分离的病原菌菌株为栗疫菌C.parasitica。

2.2 栗疫病抗性的评价结果

17个锥栗农家品种栗疫病抗性的室内与室外评价结果见表1。由表1 可知，室内接种枝条的栗疫病染病指数高于室外栗疫菌的接种结果。室外接种枝条上病斑面积最小和最大的农家品种分别为‘小尖嘴’与‘双峰子’，其病斑面积分别为12.8 和76.8 mm2；室内接种枝条上病斑面积最小和最大的农家品种分别为‘中尖嘴’与‘红仔榛’，其病斑面积分别为31.7 和95.5 mm2。室外接种枝条染病率最小和最大的农家品种分别为‘小尖嘴’与‘乌榛’，其染病率分别为 11.1%和30.3%；室内接种枝条染病率最小和最大的农家品种分别为‘中尖嘴’与‘红仔榛’，其染病率分别为22.4%和39.7%。室外接种枝条染病指数最小和最大的农家品种分别为‘小尖嘴’与‘乌榛’，其染病指数分别为10 和50；室内接种枝条染病指数最小和最大的农家品种分别为‘中尖嘴’与‘处暑红’，其染病指数分别为33.3 和70.0。17个锥栗农家品种栗疫病抗性的综合评价结果见表2。17个锥栗农家品种中，没有对栗疫病的侵染表现出免疫级(I)抗性的农家品种；‘中尖嘴’‘黄榛’‘铁锥’‘油桐仔’‘小尖嘴’‘牛角仔’（晚熟）‘牛角仔’（中熟）‘白露子’这8个农家品种对栗疫病的侵染均表现出R 级（较抗）的抗性；‘大包榛’‘大尖嘴’‘油榛’‘欧宁仔’这4个农家品种对栗疫病的侵染均表现出S 级（易感）的抗性；‘处暑红’‘双峰子’‘乌榛’‘乌壳长芒’‘红仔榛’这5个农家品种对栗疫病的侵染均表现出H 级（高感）的抗性。

表1 栗疫病抗性评价结果Table 1 Evaluation results of resistance to chestnut blight

表2 栗疫病抗性综合评价结果Table 2 Comprehensive evaluation results of chestnut blight resistance

2.3 栗疫病抗性和果实表型性状的变异分析

17个锥栗农家品种栗疫病抗性和果实表型性状的变异分析结果见表3。由表3 可知，17个锥栗农家品种的15个表型性状指标均存在不同程度的变异。果实成分表型性状中，‘欧宁仔’果实中可溶性糖含量的变异系数（43.66%）最大；‘油桐仔’果实中还原糖的变异系数（0.39%）最小。栗疫病表型性状中，‘黄榛’栗疫病染病率的变异系数（32.42%）最大，‘小尖嘴’栗疫病染病率的变异系数（11.17%）最小。果实形态表型性状中，‘油榛’果质量的变异系数（42.72%）最大，‘红仔榛’果苞高的变异系数（0.63%）最小。

表3 栗疫病抗性和果实表型性状的变异分析结果Table 3 Variation analysis results of chestnut blight resistance and fruit phenotypic traits

续表3Continuation of table 3

续表3Continuation of table 3

2.4 栗疫病抗性和果实表型性状的方差分析结果及重复力的估算结果

17个锥栗农家品种栗疫病抗性和果实表型性状的方差分析结果见表4。由表4 可知，17个农家品种之间除淀粉含量（P=0.275）外的14个表型性状指标均存在极显著差异（P≤0.01）；淀粉含量的重复力值（0.208）最小，还原糖含量的重复力值（0.999）最大，平均重复力值为0.883，表明17个农家品种表型性状的稳定性均较好，其中果苞厚和淀粉的重复力值均较小，表明这两个性状指标受环境影响较大。

表4 栗疫病抗性和果实表型性状的方差分析结果†Table 4 Variance analysis results of chestnut blight resistance and fruit phenotypic traits

续表4Continuation of table 4

2.5 栗疫病抗性和果实表型性状的相关性分析

17个锥栗农家品种栗疫病抗性和果实表型性状的相关性分析结果见表5。由表5 可知，15个表型性状间存在一定的相关性，染病率与可溶性糖呈现极显著负相关，相关系数为-0.415（P≤0.01）；染病率与蔗糖呈现显著负相关，相关系数为-0.292（P≤0.05），染病率与果实其他表型性状间均无显著相关性。

表5 15个表型性状间的相关性分析结果†Table 5 Correlation analysis results of 15 phenotypic traits

2.6 优良农家品种的选择

对17个锥栗农家品种的栗疫病抗性和9个果实表型性状指标测定值进行标准化分析，结果见表6。经过对所测数据的标准化分析，从17个锥栗农家品种中筛选得到了‘大包榛’‘白露仔’‘黄榛’这3个抗疫病性较强且果实品质优良的农家品种，其余14个农家品种按其抗疫病性的强弱和果实品质的优劣排序依次为：‘乌榛’‘处暑红’‘小尖嘴’‘铁锥’‘油桐仔’‘中尖嘴’‘大尖嘴’‘欧宁仔’‘油榛’‘红仔榛’‘牛角仔’（中熟）‘乌壳长芒’‘牛角仔’（晚熟）‘双峰子’。

表6 栗疫病抗性和果实表型性状指标测定值的标准化值Table 6 Standardized values of measured values of chestnut blight resistance and fruit traits

续表6Continuation of table 6

2.7 栗疫病抗性和果实表型性状的聚类分析

17个锥栗农家品种栗疫病抗性和果实表型性状的聚类分析结果如图3所示。由图3 可知，‘牛角仔’（中熟）单独分为1 类；第2 类包括‘牛角仔’（晚熟）‘油桐仔’‘处暑红’‘红仔榛’‘乌榛’；第3 类包括‘欧宁仔’‘中尖嘴’‘油榛’‘乌壳长芒’‘双峰子’‘小尖嘴’‘大尖嘴’‘铁锥’‘大包榛’‘白露子’‘黄榛’。

图3 17个锥栗农家品种的聚类分析结果Fig.3 Cluster analysis results of 17 C.henryi Cultivars

3 讨 论

植物病害抗性评价大多数都是针对植株活体或者离体枝条、叶片接种病菌进行的，以病斑面积、染病率、染病指数这3个指标为依据，能较准确地反映出样本对病害的抗性。有关小麦[23-24]、玉米[25]、水稻[26]等作物的抗病研究均较透彻。朱玫等[27]研究了36个国家审定小麦品种的抗病性、农艺性状和品质，结果发现，不同品种之间小麦的品质和抗病性的差异均较大。温辉芹等[28]对129个品种小麦的品质性状和抗条锈病进行了分析和评价，结果表明，所有的小麦品种均不是抗锈病的优良种质。王桂跃等[29]分别研究了76个品种的甜玉米和89个品种的糯玉米的产量、品质和抗病性，结果表明，其产量和品质性状均存在明显差异，通过综合分析，筛选获得了17个抗性较强且果实品质较优的玉米品种。王金明等[30]对全球66 份水稻育种亲本的稻瘟病抗性与稻谷品质进行了研究，从中筛选出了11个具有中等抗性、稻米外观表现优良的水稻品种。有关板栗疫病的研究成果较多：徐育海等[18]分别对夏、冬两个季节的31个板栗基因型进行离体枝条栗疫菌接种试验，他们根据抗性等级的不同，将其分为不同的板栗基因类型，并得出了夏季接种栗疫菌的枝条所表现出的抗性强于冬季接种枝条的结论。程中平等[19]利用3个菌株，分别于5个时期对其离体枝条进行接种试验，并观察其染病程度，结果筛选出了5个抗性较强的基因型；秦岭等[20]利用两种菌株对21个板栗基因型的疫病抗性进行枝条离体接种试验，也筛选出了部分抗性较强的基因型，他们研究得出了其对栗疫病的抗性表现较为稳定且一致的结论。有关栗属树种栗疫病的研究结果为揭示栗疫病菌的侵染机理、挑选抗性基因、开展栗疫病防治等方面的研究奠定了基础，也为有关锥栗的抗病研究提供了重要的参考依据。将作物的抗病性与果实品质性状联合起来分析进行良种选择的研究报道已有很多，而将锥栗乃至经济林木的抗病性与果实品质联合起来分析进行良种选择的研究报道较少，本研究尝试结合栗疫病抗性与锥栗果实品质进行分析和综合评价，在选择抗性个体的同时，也兼顾果实品质，最终获得抗疫病能力较强、品质性状又优良的农家品种。但是，本研究的局限性在于只用了1年的观测数据。

栗疫病自被发现之日起，就给栗属植物带来了难以逆转的危害。采用常规防治方法难以彻底遏制栗疫病的传播与流行，只有选育出抗性强的优良品种才能从根本上解决栗疫病的危害问题。目前，杂交育种仍然是抗病选育的主要手段之一。选择抗性与品质差异均较大的锥栗进行有性杂交，可使双亲的基因重新组合，将两者的优良基因集于子代一身，子代甚至可能出现强于亲本双方的超亲现象。板栗是公认的抗疫病能力较强的种质，开展锥栗与板栗的种间杂交，有望在其子代中选育出抗疫病且果实品质优良的基因型。传统的杂交育种周期较长，在基因组测序的基础上开展分子标记辅助选择育种，通过常规育种与分子育种相结合，可提高锥栗育种的效率与精度，最终才可选育出抗性强、产量高、品质优的品种，以促进锥栗产业的可持续发展。

4 结 论

对17个锥栗农家品种间抗病性和果实表型性状的相关性进行了分析，结果表明，其抗病性与果实各性状指标之间存在不同程度的相关性：染病率与果苞刺长呈显著正相关；染病率与可溶性糖、蔗糖、可溶性蛋白之间均呈负相关，与可溶性糖呈极显著负相关，而与淀粉、还原糖之间均呈正相关。这一分析结果说明，17个锥栗农家品种抗疫病能力越强，其果实中可溶性糖、蔗糖、可溶性蛋白的含量可能越高，而其淀粉和还原糖的含量越低。变异分析结果表明，17个锥栗农家品种在抗病性和果实表型性状上均存在明显的变异，较大的变异有利于我们从中选择出符合目标要求的个体。结合抗病性与果实品质性状进行分析与综合评价及联合选择是可行的，本研究从17个农家品种中最终选择出了‘大包榛’‘白露仔’‘黄榛’这3个抗疫病能力较强、果实品质优良的农家品种。