枣树花叶病毒病的分子检测

白剑宇，罗 达，刘正兴，李 宏

(1.新疆林业科学院经济林研究所，乌鲁木齐 830063；2.新疆林业科学院，乌鲁木齐 830063；3.阿克苏地区农业农村局，乌鲁木齐 834000)

0 引 言

【研究意义】枣树花叶病毒病病原为山梣环斑病毒属(Emaravirus)中的一个新种，暂命名为中国枣树花叶伴随病毒(Chinese date mosaic-associated virus，CDMaV)[1]。该病传播速度快，危害严重，前期隐症不易发现，一旦显症就已错过最佳防治时间。常规的症状观察和病原的电镜扫描鉴定方法熬时长、程序繁琐，很难实现对病害发生动态的及时监测和有效控制病害的传播和流行。建立枣树花叶病毒病的快速、准确的分子检测技术，对于探索病害防控的关键点以及制定适时有效的防治措施提供重要的理论依据和指导。【前人研究进展】2016年9月，枣树花叶病毒病在新疆红枣主产区阿克苏地区发生。该病害主要危害枣树叶片和果实，造成叶片斑驳、卷曲，树势明显减弱，受害果实初期在果面上出现水浸状褪绿斑，随后病斑凹陷，果实畸形，后期逐渐萎缩脱落，造成整株产量损失在30%以上。依据病害症状特点，初步判断该病害为植物病毒侵染所致。病害叶片样本经小RNA深度测序分析[1-2]，分析预测结果指向病毒。以小RNA测序分析结果为指向，采用分段设计特异性引物，通过RT-PCR技术对缺失部分的基因序列扩增并测序，采用RACE法分别扩增各条RNA片段的5，末端和3，末端序列，利用生物信息学软件组装出病毒的全基因组序列，并通过生物学信息的比对分析将病毒鉴定为山梣环斑病毒属(Emaravirus)中的一个新种，暂命名为中国枣树花叶伴随病毒[3]，通过对危害枣树的枣瘿螨进行病毒检测，同样在枣瘿螨体内检测到了CDMaV的存在，符合该属病毒由瘿螨科传播的特征[4-7]。2015年白剑宇等[8-10]报道了由Alternariaalternata和Notherphomaquercina侵染枣树的3种新病害以来，再次发现的一种由病毒侵染引起的枣树新病害。【本研究切入点】研究在获得基因组全序列的基础上，以病毒基因组RNA5基因序列为靶标，利用primer5.0 软件设计灵敏度极高的特异性引物，通过PCR反应体系优化后的引物特异性扩增与灵敏度的检测，建立枣树花叶病的分子检测技术，并利用该技术在红枣整个生育期进行病害侵染动态的追踪检测与分析。【拟解决的关键问题】追踪检测病害田间侵染动态，研究枣树花叶病毒病田间侵染动态，分析病害防治的关键时间节点，为新疆枣树花叶病毒病的流行监测和早期防治提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 枣树花叶病毒病样本

枣树花叶病毒病阳性对照样本为实验室收集于阿克苏和喀什两个地州的枣树花叶病毒病叶片，提取总RNA后经反转录合成的cDNA，并保存于-80℃低温冰箱的叶片cDNA样本。引物特异性验证材料由新疆林科院有害生物实验室收集于新疆不同地区不同作物病毒病的叶片样本，提取总RNA后经反转录合成的cDNA，并保存于-80℃低温冰箱的叶片cDNA样本，包括枣疯病、苹果花叶病、无花果病毒病、丁香病毒病、苜蓿病毒病、番茄黄化曲叶病毒病和西甜瓜病毒病等7种作物病毒病cDNA阳性样本。追踪检测材料是在枣树整个生育期内的不同时间点自不同监测点采集到的疑似枣树花叶病毒病叶片样本(300份)。

供试引物：依据CDMaV基因组RNA5序列，利用Primer5.0软件设计的一对特异性引物JUP5-F(5’-CAAGCATAGCAATTGATGAC-3’)和JUP5-R(5’-ACTTGATCTATGGACTGAAC-3’)，预计产物片段大小为432 bp，作为RT-PCR的检测内参，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 主要试剂和仪器

BIO-RAD T100 PCR，美国伯乐中国上海分公司；DYY6C 电泳仪，北京六一生物科技有限公司；KCBIO2008凝胶成像系统，北京原平皓生物技术有限公司；Trizol总RNA提取液、反转录试剂盒，以及2×PCR反应液等试剂购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方 法

1.2.1 叶片样本RNA提取与RT-PCR

按照Trizol RNA提取试剂操作说明分别提取300份采自不同监测点的枣树花叶病毒病叶片样本的总RNA。采用美国Bio-Rad公司的反转录试剂盒对上述各样本总RNA进行反转录，反转录后的cDNA样本放于-80℃超低温冰箱保存备用，反转录合成体系及反应条件如下：取-70℃保存的枣树新病毒病叶片总DNA阳性样本作为阳性对照，以灭菌的双蒸水为阴性对照，以枣疯病、苹果花叶病毒、无花果病毒、西甜瓜病毒、苜蓿花叶病毒、番茄黄化曲叶病毒、丁香环斑病毒等7种作物的叶片总DNA做为特异性检测的对照。反转录合成体系为：5倍的反转录反应液4 μL，反转录酶 1 μL，RNA模板 5 μL，无RNA酶的dd H2O补足至20 μL。反转录合成条件：25℃，5 min；85℃，5 min，42℃，30 min，4℃保存。

1.2.2 引物的特异性检测

取-80保存的枣树花叶病毒病叶片总cDNA阳性样本作为阳性对照，以灭菌后的双蒸水为阴性对照，以枣疯病、苹果花叶病毒、无花果病毒、西甜瓜病毒、苜蓿花叶病毒、番茄黄化曲叶病毒、丁香环斑病毒等7种作物的叶片总cDNA作特异性检测的阴性对照，利用引物(JUP5-F)/(JUP5-R)对来源于不同作物病毒病叶片的cDNA样本进行PCR的特异性检测。PCR 反应体系(20 μL)：10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，2×PCR反应液10 μL，模板 cDNA 2 μL，dd H2O 6 μL。PCR 反应条件：95℃，10 min；94℃，1 min，56℃，45 s，72℃，2 min，35 个循环；72℃延伸 10 min。

1.2.3 引物的灵敏性检测

将-80℃保存的枣树花叶病毒病叶片总cDNA阳性样本用紫外分光光度计测定浓度后，取阳性cDNA样本10 μL，按10倍梯度稀释(107、106、105、104、103、102、10、1)8个不同浓度，采用已建立的RT-PCR技术体系进行扩增，检测引物(JUP5-F)/(JUP5-R)的灵敏度。

1.2.4 枣树花叶病毒病田间发生动态追踪监测

依据枣树花叶病毒病在新疆南疆地州的发生与分布情况，选取枣树花叶病毒病发生较重的地块作为病害田间发生动态追踪检测的对象，包括阿克苏市依杆旗乡、巴楚县阿拉格尔乡和岳普湖县巴依阿瓦提乡红枣种植园，总面积约26.67 hm2(400亩)。枣树品种均为灰枣，树龄分别为7年、8年和10年。自2019年5月初枣树展叶期至8月中、下旬枣树花叶病毒病叶片显症高峰期，采用5点取样法分别于5、6、7和8月采集疑似枣树花叶病毒病叶片样本，每个枣园每个时间点各取25份，提取各样品总RNA，利用已建立的RT-PCR 技术进行带毒率的分子检测和病害田间侵染动态分析。表1

2 结果与分析

2.1 引物的特异性检测

研究表明，检测引物(JUP5-F)/(JUP5-R)对供试枣树花叶病毒病叶片样本总cDNA均能稳定地扩增出432 bp单一的目的条带，而其它不同作物的cDNA样本和阴性对照均未扩增出明亮的目的条带，扩增稳定性好，特异性强。图1

注：M：100 bp Marker；1～3：枣树花叶病毒；4～5：枣疯病；6～7：苹果花叶病毒；8～9：无花果病毒；10～11：西甜瓜病毒；12～13：苜蓿花叶病毒；14～15：番茄黄化曲叶病毒；16～17：丁香环斑病毒；CK：阴性对照

2.2 引物的灵敏性检测

研究表明，枣树花叶病毒病叶片阳性样本总cDNA的分光光度计测定浓度为0.479 ng/μL，将初始cDNA梯度稀释至105倍液(4.79 pg/μL)时，仍能检测到目的条带，说明(JUP5-F)/(JUP5-R)引物在优化的RT-PCR反应体系条件下，对枣树花叶病毒病具有较高的检测灵敏度，可用于枣树花叶病毒病病原的田间侵染动态的追踪检测与验证。图2

注：M：DNA Marker；1～8：cDNA 依次稀释梯度为1～107倍液；CK：阴性对照

2.3 枣树花叶病毒病田间侵染动态的追踪检测

研究表明，3个枣园不同时期采集的疑似枣树花叶病毒病叶片样本均可检测到枣树花叶病毒的存在，且随着月份的增加，病原检出率呈逐渐升高的趋势。其中5月采集的枣树叶片样本的病菌检出率相对较低，最高检出率为28%，最低检出率为20%，而在6月采集的叶片样本中病害检出率明显升高5月的病害检出率，7～8月达到高峰，检出率在80%以上，最高达100%。表1

表1 样品材料及枣树花叶病毒病田间发生动态的检测结果

3 讨 论

枣树花叶病毒病是2016年研究团队在新疆阿克苏地区发现的一种国际新病害。杜凯桐等[11]在北京地区表现花叶病的枣树上发现并报道了1种引起枣树花叶的DNA病毒(JuMaV), 并对其基因组进行了测序分析，获取了该病毒的全基因组序列，该病毒侵染枣树，仅造成侵染叶片黄化畸形，而针对新疆阿克苏地区枣树上表现花叶症状的叶片和畸形的果实样品进行测序分析，分离鉴定到一种负链RNA病毒，该病毒为山梣环斑病毒属(Emaravirus)中的一个新成员[12]。目前，该病毒仅在中国发生，针对该枣树花叶病病原及侵染循环规律的研究尚处于初始阶段，该病毒是否是枣树病毒病的主要病原，还需要后续的试验验证。依据前期调查与研究结果，该病害不仅叶片表现黄花卷曲，还危害果实，造成果实畸形，提早脱落。该病一般在每年的7月初首先在当年生枣头枝上的幼嫩叶片显症，前期没有明显的发病症状，果农通常忽略前期对枣树病毒病的防治，仅在叶片或枣果显症期进行防治，致使防治效果很难达到预期的目标。利用分子检测技术开展枣树病毒病的早期诊断与监测，探索病害防治的关键时间节点显得尤为重要。因此，在小RAN深度测序分析的基础上，获得了枣树病毒病病原的全基因组序列，并以基因组RNA5序列设计出一对高特异性引物，建立了针对枣树花叶病毒病RT-PCR分子检测技术，检测灵敏度达到4.79 pg/μL，引物(JUP5-F)/(JUP5-R)特异性强而且灵敏度高，具有实际可操作性，可用于枣树花叶病毒病田间侵染动态的追踪检测。

在枣树花叶病毒病田间追踪检测研究中，发现3个枣园不同时期采集的疑似枣树花叶病毒病病害样本病原检出率随着月份的增加呈逐渐升高的趋势。众所周知，作物病毒病是一个系统侵染病害，但枣树花叶病毒病的潜伏期长，症状一旦出现便已错过了病害防治的关键时间节点。

4 结 论

在前期获得枣树花叶病毒病病原的全基因组序列的基础上，以基因组RNA5序列设计出一对高特异性引物(JUP5-F)/(JUP5-R)，通过反应体系的优化组合建立了枣树花叶病毒病的RT-PCR分子检测技术，检测灵敏度达到4.79 pg/μL。该引物对特异性强而且灵敏度高，具有实际可操作性，可作为枣树花叶病毒病田间侵染动态的追踪检测。

枣树叶片带毒率随着月份的增加而增加，最佳防控时间节点在5月中下旬。其中5～6月检出率较低，7～8月的检出率明显高于5～6月，这与病害前期隐症，7月叶片显症，8月进入显症高峰期的田间调查结果相一致。