人源乳酸菌对2型糖尿病小鼠的缓解效果

佟 童， 王 璇， 邵新宇， 李雨欣， 牛晓辉， 田思琪， 李祖明*， 张 弓， 刘 佳， 白志辉， 夏 然， 武志超

(1.北京联合大学 生物化学工程学院，北京 100023；2.中加健康工程研究院(合肥)有限公司，安徽 合肥 230088；3.国贸食品科技(北京)有限公司，北京 102209; 4.中国科学院 生态环境研究中心, 北京 100085)

糖尿病是一种代谢疾病，分为1型糖尿病和2型糖尿病(T2DM)，随着发病率的增加和发病人数的不断上升，其已成为世界范围内主要公共问题之一[1-2]。在所有糖尿病患者中，T2DM患者约占90%[3]。T2DM是一种以高血糖、高血脂为特征的代谢疾病，主要由胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足引起[4-5]。T2DM患者通常表现为多饮、多食、多尿，并伴随着高血压、甘油三脂增加、高密度脂蛋白降低、高胰岛素血症及胰岛素抵抗、胰岛细胞功能减退、炎症反应等现象，可导致代谢紊乱，如脂肪、蛋白质、水和电解质等代谢紊乱，还可引起心脑血管、肾脏功能衰竭和心脏病变等多种并发症[3-4]。T2DM是复杂的基因环境相互作用的结果，不仅与人体基因有关，还与肠道微生物组有关[6]。人体的肠道菌群是一个复杂的生态系统，是胃肠道稳态的重要组成部分，是影响人体健康的重要因素之一[6-7]。肠道菌群的紊乱会导致宿主系统稳态失衡使致病菌得到生长的机会[8]。已有研究表明，可以通过改变肠道微生物来控制糖尿病等代谢疾病[9]。肠道菌群既能直接作用肠道中的上皮细胞，也能通过内分泌和免疫系统影响宿主，从而达到改善T2DM患者空腹血糖、减少胰岛素抵抗，还可降低胆固醇合成、预防和治疗心血管疾病[10-12]。乳酸菌属于益生菌，且在商业菌株中较为常见[13]。乳酸菌具有调节人体机能、延缓衰老和预防疾病的作用，在抵抗糖尿病方面也越来越受到研究人员的重视[14]。由于外源益生菌和人体益生菌生长环境的不同，许多学者认为益生菌最好来源于人体的胃肠道[15]。本研究利用北京联合大学食品科学与工程一级学科食品安全团队实验室分离得到的4株人源乳酸菌，包括2株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和2株发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)制作的菌粉进行动物实验，考察其对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的缓解效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 人源乳酸菌菌粉是由北京联合大学食品科学与工程一级学科食品安全团队实验室从健康成年人体内分离得到的菌株制成，其中含有2株发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum11、Lactobacillusfermentum305)和2株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum22、Lactobacillusplantarum25)。

1.1.2 试验动物 C57BLKS/J小鼠、db/db小鼠，6周龄，雄性，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。

1.1.3 试剂与仪器 葡萄糖(北京化工厂)；胰岛素(诺和诺德(中国)制药有限公司)。快速血糖仪(Accu-Chek Active，罗氏集团)；一次性无菌注射器(1 mL，江苏治宇医疗器材有限公司)；高速冷冻离心机(5804R，德国Eppendorf公司)；全自动生化分析仪(7180，日本日立高新技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 所有小鼠适应性饲养1周后，12只C57BLKS/J小鼠作为空白对照组(NC)，24只db/db小鼠分为模型组(MC)、乳酸菌灌胃组(L)，每组12只。灌胃剂量：每种菌浓度为109cfu/mL，每只鼠每天10 mL/kg。NC组和MC组每天灌胃等剂量无菌生理盐水，实验进行12周。

1.2.2 小鼠进食量和体质量 每周称量1次小鼠体质量和饲料质量，计算每周进食量。

1.2.3 空腹血糖(FBG) 每周测量1次小鼠血糖。小鼠禁食6 h，用75%酒精对小鼠尾尖和采血针消毒，挤压小鼠尾尖血滴于血糖试纸上，使用快速血糖仪读取血糖读数。

1.2.4 口服糖耐量试验(OGTT) 口服糖耐量试验在小鼠干预第10周末进行。小鼠禁食12 h后灌胃40%葡萄糖溶液(1 g/kg)，在0、30、60和120 min时尾尖取血，使用快速血糖仪测量血糖。将血糖值绘制曲线，计算曲线下面积(AUC)表示葡萄糖耐量。AUCglucose=0.5×((G0+G30)/2+(G30+G60)/2+(G60+G90)/2+ (G90+G120)/2)。式中，G0:0 min时小鼠血糖值，G30:30 min时小鼠血糖值，G60:60 min时小鼠血糖值，G90:90 min时小鼠血糖值，G120:120 min时小鼠血糖值。

1.2.5 胰岛素抵抗试验(ITT) 胰岛素抵抗试验在小鼠干预第11周末进行。小鼠禁食6 h后，腹腔注射胰岛素(0.75 U/kg)。在0、30、60和120 min时尾尖取血，使用快速血糖仪测量血糖。将血糖值绘制曲线，计算曲线下面积(AUC)表示葡萄糖抵抗能力。计算公式同1.2.4。

1.2.6 血生化指标测定 将小鼠摘眼球取血于1.5 mL离心管中，4 ℃，4 000 r/min离心10 min后取上清。使用全自动生化仪检测甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和总胆固醇(TC)。

2 结果与分析

2.1 小鼠体质量变化

各组小鼠体质量变化如图1所示，与正常小鼠相比，2型糖尿病小鼠体质量显著增加。在实验开始时MC组和L组小鼠体质量无显著性差异；实验结束时，L组小鼠体质量低于MC组，但无显著性差异。

图1 小鼠体质量变化Fig.1 Changes in body weight of mice不同字母表示显著性差异(P<0.05),下图同Significant difference(P<0.05) are indicanted with different letters,the same below

2.2 小鼠进食量变化

各组小鼠进食量变化见图2，糖尿病小鼠的进食量显著高于正常小鼠。经过实验干预后，MC组小鼠一直保持较高进食量，L组进食量减少；实验结束时,L组的进食量显著低于MC组。

2.3 空腹血糖变化

各组小鼠空腹血糖变化如图3所示，实验开始前糖尿病小鼠血糖显著高于正常小鼠，且MC组和L组之间无显著性差异。随着实验的进行，NC组小鼠血糖一直稳定在正常水平。MC组小鼠血糖逐渐升高后保持在较高水平。L组小鼠血糖在实验前期逐渐升高后趋于平稳，但实验后期L组小鼠血糖显著低于MC组。

图2 小鼠进食量变化Fig.2 Changes in food intake of mice

图3 小鼠血糖变化Fig.3 Changes in blood glucose of mice

2.4 口服葡萄糖耐量实验(OGTT)

灌胃葡萄糖后小鼠血糖变化如图4A所示，小鼠灌胃葡萄糖后30 min时，血糖达到最大值。MC组小鼠血糖达到最高后下降缓慢，120 min时血糖依然保持较高水平。L组小鼠血糖在30 min后下降，在60、90和120 min时，血糖低于MC组。曲线下面积(图4B)显示，MC组对葡萄糖耐量严重受损，L组对糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力有所修复。

图4 口服葡萄糖耐量实验血糖变化和曲线下面积Fig.4 Changes of blood glucose and area under the curve of oral glucose tolerance test

2.5 胰岛素抵抗(ITT)实验

小鼠注射胰岛素后血糖变化如图5A所示，NC组和L组小鼠血糖在注射胰岛素30 min后，血糖达到最小值，在120 min内恢复到初始血糖浓度。MC组小鼠在注射胰岛素后60 min时，血糖达到最小值，说明MC组小鼠对胰岛素抵抗严重。由曲线下面积(图5B)可知，MC组对胰岛素抵抗显著高于NC组，L组却显著低于MC组。

图5 胰岛素抵抗实验血糖变化(A)和曲线下面积(B)Fig.5 Changes of blood glucose (A) and area under the curve (B) in insulin resistance test

2.6 血清中血脂指标变化

各组小鼠血清中血脂指标如图6所示。与NC组相比，MC组的LDL、TG、TC均显著升高。与MC组相比，L组这3项指标均显著下降。与NC组相比，MC组HDL显著降低；与MC组相比，L组HDL有所增加但无显著差异。

图6 血清中血脂指标Fig.6 Blood lipid index in serum

3 讨 论

人类益生菌和肠道微生物组之间存在特定的相互选择关系，这种关系可以促进人类肠道的微生态平衡[16]。理想的益生菌应该是人源益生菌，由于乳酸菌属在人体中被发现，因此乳酸菌经常被分离出来检测其益生活性且尝试将其作为益生菌[17]。通过补充乳酸菌来调节肠道菌群从而达到预防和治疗疾病的目的是目前和将来发展的一个热点[15]。目前已有一些关于乳酸菌对糖尿病干预的研究。Kinariwala等[18]在乳品中分离了10株乳酸菌(L.fermentum、L.rhamnosus、L.helveticus、L.casei)等，研究其培养物对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和胰腺脂肪酶活性的抑制效果。高伟华等[19]研究了从传统发酵乳制品中分离出来的乳酸菌对高糖高脂2型糖尿病小鼠血脂的影响。曾珠等[20]研究表明传统乳制品来源的10株乳杆菌可作为潜在的辅助降血糖的益生菌株。也有研究人员开展了人源乳酸菌在治疗糖尿病方面的应用。Panwar等[21]在婴儿粪便中分离出了植物乳杆菌(L.plantarum)、发酵乳杆菌(L.fermentum)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)，研究其抗糖潜力。Chen等[22]在人体粪便中分离出了鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus) Z7，通过体外实验评估其抗糖潜力和益生特性。关于人源乳酸菌对糖尿病影响的研究较少，多菌株联合干预的研究更少。

T2DM的主要特征是胰岛β细胞受损、胰岛素分泌不足，患者处于高血糖状态[23]。糖尿病常见的急性代谢病之一就是高血糖，高血糖可使患者出现昏迷、休克、意识丧失等，严重时甚至导致死亡[24-25]。所以控制血糖在治疗和预防T2DM中尤为重要。本研究发现，与MC组相比，L组小鼠的血糖显著下降，葡萄糖耐量和胰岛素抵抗能力显著提高，表明这4株人源乳酸菌菌粉对T2DM小鼠具有缓解作用。T2DM患者大多会出现血脂指标失衡的病状[26]。血脂异常一般表现为总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的异常[27]。糖脂代谢之间关系密切，控制血糖和控制血脂同样关键。本研究中，与MC组相比，L组小鼠的血脂指标得到显著改善；L组低密度脂蛋白、总胆固醇和甘油三酯显著降低，显示这4株人源乳酸菌对血脂具有调节作用。

本文主要研究了4株人源乳酸菌对2型糖尿病小鼠在糖脂代谢方面的缓解效果，结果表明经过4株人源乳酸菌菌粉灌胃后，2型糖尿病小鼠的血糖、进食量、低密度脂蛋白、总胆固醇和甘油三酯显著降低(P<0.05),葡萄糖耐量和胰岛素抵抗能力显著提高(P<0.05)，体重无显著性变化，高密度脂蛋白增加但不显著。可见这4株人源乳酸菌对2型糖尿病小鼠具有缓解效果，为人源益生菌制品在2型糖尿病上的应用提供了参考。但是关于这4株人源乳酸菌对2型糖尿病的影响还需要深入研究，探索其作用机制。