高效降解巨龙竹白腐菌株筛选及降解机制研究

杨 雄 史正军 赵长林

（1. 西南林业大学生物多样性保护学院，云南 昆明 650233；2. 西南林业大学化学工程学院，云南 昆明 650233）

木质素在自然界中含量非常丰富，它是一种拥有极其复杂结构的天然高分子化合物，在高等植物细胞壁中木质素广泛存在，是仅次于纤维素的一种生物多聚体化合物[1-2]，微生物难以降解木质素的原因在于木质素中各种生物学稳定的复杂键型[3]。如何高效率的利用这类作物资源为目前所研究的热点课题，传统工业制备纤维素材料的方法不仅浪费大量的化学资源和能源，产生的制浆废液也污染环境[4-5]；白腐真菌是目前应用广泛的、公认安全环保且无公害的可以将木质素降解为简单无机物的一类微生物[6]。木材腐朽真菌主要包括白色腐朽菌和褐色腐朽菌2种[7-8]，其中白色腐朽真菌是木材腐朽真菌中最大的类群，包括大部分木生担子菌、少数子囊菌和半知菌[9-13]，大多白腐菌可产生漆酶和锰过氧化物酶，极少数能产生木质素过氧化物酶[14-16]，使木质素发生侧链氧化断裂、β-芳醚键断裂、芳香环氧化开裂以及苯环上脱甲氧基或甲基化反应而降解[17]；同时木材腐朽真菌也是森林生物多样性的重要组成部分，在森林生态系统中起着关键的降解还原作用，能维持森林生态系统的物质循环和能量流动[18-20]。

巨龙竹（Dendrocalamus sinicus）属禾本科竹亚科牡竹属竹种，热带巨大型丛生竹，为我国特有物种，发现于云南省西南部临沧、西双版纳地区，其生长速度快、经济用途广、生态效益显著，作为一种特色明显的资源植物具有很大的开发潜力和广泛的应用前景[21-26]；因该物种发现时间较晚，分布地区科研资金投入不足、科研水平相对落后，对巨龙竹深入开发应用欠缺，尤其在巨龙竹木质素降解研究方面还远远不够[27-28]，如巨龙竹在制浆造纸、人造板材和生物精炼工业领域有极高的开发潜力，但由于木质素的存在导致纤维素在分离过程中呈现耗能高、污染大、耗时多、产量低、其不仅浪费资源同时污染环境[4-5,29]。因此，针对目前存在木质素限制竹资源高效深度开发利用，传统物理化学预处理方法既不经济又不环保的问题，本研究提出利用生物方法降解竹材中的木质素观点，并利用固体发酵法和化学测定法筛选高效降解巨龙竹木质素的菌株；采用形态学与分子系统学相结合方法将该菌株鉴定；通过主成分分析揭示存在的降解类型；运用紫外扫描法揭示木质素初步降解机制。

1 材料与方法

1.1 供试材料及处理

野外调查并采集白色腐朽真菌，并记录采集编号、采集地点、寄主信息，将新鲜标本带回实验室进行分离纯化，将分离纯化出的白色腐朽真菌菌株保存于4 ℃冰箱备用。本研究共分离纯化出可用于巨龙竹竹材降解的菌株30号（表1），现保藏于西南林业大学真菌标本馆（SWFC）。巨龙竹材料采自于云南省临沧市的沧源地区。

表 1 供试白腐菌株Table 1 The information for the test strain of white rot fungi

续表 1

1.2 竹材降解试验

1.2.1竹材的固体发酵

1）将新鲜的巨龙竹切成约3 cm×1 cm×0.3 cm的竹片，放入烘箱105 ℃烘干至恒质量。

2）将上述烘干后的竹片取出5 g（精确到0.000 1 g）分别放入培养皿中写上标签，依次加入适量的水，充分淹没浸泡12 h。

3）到达规定时间后，沥干表面水分，121 ℃灭菌30 min备用。

4）取供试菌株菌柄饼（约1 cm2）接种在装有2%麦芽浸粉培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃湿度75%静置培养。

5）待菌丝长满培养基表面，放入上述灭菌的5 g竹片，用接种针将其均匀分布于培养基表面，放入恒温恒湿箱培养箱，温度28 ℃、湿度75%静置培养30 d；每个菌种2个重复，未接种的2组竹片作为空白对照组。

6）30 d后取出样品，洗去木片表面的菌丝（洗的过程应防止竹材的细小部分掉落，影响失重率的测定），105 ℃风干至恒质量[30]。

1.2.2竹材化学组分的测定

用定性滤纸将上述风干后的样品包好并用棉线捆牢，参照国标GB/T 2677.6—1994[31]加入苯醇混合液进行抽提，每小时约4次循环，抽提时间为6 h，然后将抽提好的样本放入烘箱105 ℃烘至恒质量，参照国标GB/T 2677.10—1995[32]测定综纤维素含量，参照国标GB/T 2677.8—1994测定Klason木素含量[30]。

1.2.3失重率、木质纤维素降解率及选择系数的计算

1.3 分析方法

1.3.1主成分分析方法

利用SPSS数据分析软件，将竹材失重率及各化学变量提取2个主成分并计算其主成分得分系数。根据得分系数计算出每株菌的主成分得分，并做出主成分分析散点图[30]。

1.3.2紫外扫描分析方法

1）取1 g过40目标准筛的竹粉与适量的质量体积分数2%的麦芽浸粉培养基装入到三角瓶中（250 mL）灭菌备用；

2）向上述灭菌后的三角瓶中接入供试菌株的菌饼（约1 cm2），放入培养箱恒温恒湿静置培养20 d。未接种的作为对照组，处理同上；

3）培养20 d后，向每个三角瓶中加入50 mL 95%乙醇，瓶口覆盖上锡箔纸，50 ℃发酵1 h；

4）发酵结束后放入冰箱中冷却至室温；

5）取2 mL菌液放于离心管中，10 000 r/min离心2 min；

6）取上清液以1∶10的比例与95%乙醇混合稀释；

7）室温下测220～400 nm的光谱值[30]。

1.4 菌株鉴定方法

1.4.1DNA提取、PCR扩增及系统发育分析

OMEGA HP Fungal DNA Kit试剂盒用于SWFU 000072菌株DNA基因组提取[33]。本研究选用ITS基因片段完成系统发育分析，引物ITS5/ITS4[34]，订购在生工生物工程（上海）股份有限公司。ITS片度PCR程序参考木腐菌系统发育研究[33]，产物纯化和测序均送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司。

DNA序列用MAFFT version 7（http://mafft.cbr.jp/alignment/server）进行比对，手工校正和去掉两端参差排列后保存为NBRF/PIR格式文件，再用ClustalX 1.83[35]将NBRF/PIR格式文件转化为NEXUS格式文件以及PHYLIP格式文件；经过编辑后用于系统发育树的构建。系统发育树构建采用PAUP* 4.0b10[36]中的最大简约法（maximum parsimony analysis）；设置如下：1）非模糊排列的缺失位点处理为新特征（new state）；2）模糊排列位点不予采用；3）进行1 000次自持分析[37]；4）所有特征等权；5）采用启发式搜索方式（heuristic search）;（6）Max-trees设为5 000，其他参数采用默认值[37]。

1.4.2形态学研究方法

宏观研究方法：肉眼直接观察及在体视显微镜下观察林木腐朽真菌标本以下主要特征并拍照记录：

1）一般特征：一年生/多年生，有柄/菌盖/平伏反转/平伏，大小，形状，厚度，质地；

2）菌盖表面：颜色，光滑/粗糙，绒毛/粗毛，环沟/环带，边缘薄/厚，锐/钝，孔口形状及大小。

显微研究方法：所有显微研究均在Nikon Eclipse E 100显微镜和Leica DM2500（375582）生物正置荧光显微镜下进行。利用Melzer试剂（简写为IKI）、棉蓝试剂（简写为CB）和5%氢氧化钾试剂（简写为KOH）作为浮载剂。真菌定名人名称的缩写基于国际缩写标准Authors of Plant Names[38]；有关子实体的颜色术语则依据文献[39]。

2 结果与分析

2.1 竹材降解试验结果

采用30株白腐菌对巨龙竹竹片开展降解试验，经过30 d培养后，竹片失重率、综纤维素降解率、酸不溶木质素降解率发生变化（表2），其中失重率表示白腐菌对巨龙竹的分解力，其失重率越高表明其对巨龙竹的分解能力越强；由表2可知，巨龙竹竹片的失重率从0.45%至18.36%不等，竹材失重率差距较大，其中SWFU 000096的失重率最高为18.36%，表明其对巨龙竹的降解能力最强，两菌株SWFU 000089，SWFU 000013次之，失重率依次为15.53%，15.45%。当Klason木素降解率与综纤维降解率的比值（脱木质素选择系数SI）大于1时，则可以判断木腐菌产生了选择性脱木质化作用[30]。根据表2中的选择系数SI表明，30个菌株中有10株白腐菌对巨龙竹进行了选择性脱木质化作用，其菌株编号分别为SWFU 000072、SWFU 000094、SWFU 000013、SWFU 000084、SWFU 000028、SWFU 000086、SWFU 000074、SWFU 000073、SWFU 000097、SWFU 000080，其SI依次为3.10、2.71、2.04、1.80、1.70、1.66、1.25、1.22、1.09、1.05；尽管SWFU 000096对巨龙竹的分解能力最强，但其没有发生脱木质化作用，它不加选择地降解了木质素和综纤维素，其综纤维降解率高达19.16%；本研究的目的在于筛选高效选择性降解巨龙竹木质素的白腐真菌，所以该菌株不满足条件。失重率相对于SWFU 000096稍低的3个菌株SWFU 000072、SWFU 000094、SWFU 000013，SI依次为3.10、2.71、2.04，表明这3个株菌对巨龙竹的选择性脱木质化作用更显著。其中菌株SWFU 000072对酸不溶木素的降解率高达19.65%，对综纤维素的降解率仅有6.39%，且对巨龙竹综纤维损失极少，综合供试菌株降解巨龙竹的数据分析，通过SPSS软件分析了失重率和选择性系数两者的相关性，其相关性系数为0.450 12，其表明30株白腐菌降解巨龙竹的能力与其选择性系数之间没有明显的相关关系。

表 2 30株白腐菌降解巨龙竹30 d后各组分情况Table 2 Degradation of different component of D. sinicus treated by 30 white rot fungi for 30 days

2.2 主成分分析结果

为进一步解析30株白腐真菌对巨龙的降解类型，利用竹材失重率及各化学变量提取2个主成分（PC），第1主成分和第2主成分分别解释了85.43%和12.54%的变量，其表明2个主成分能解释3个指标总计97.97%的数据量。组分降解率的3个指标的数据做主成分分析（PCA），其结果显示上述3个指标。

主成分分析（PCA）结果为：Klason木质素降解率主成分得分系数PC1=0.345、PC2=1.221，综纤维降解率主成分得分系数PC1=0.354、PC2=1.074，失重率主成分得分系数PC1=0.382、PC2=0.107根据上述得分系数利用数据处理软件计算出每株菌的主成分得分，再以表2中30株白腐菌的编号后2位为序号，得出主成分分析散点图（图1），其表明当PC1的得分越高，失重率、综纤维素降解率、木质素降解率就越大；当PC2的得分越高，菌株降解巨龙竹时选择系数就越高，结果表明PC2所反映的是菌株对木质素的选择性降解。本研究主成分分析数据变化规律与微生物在其他植物降解应用研究结果分析趋势相似[30, 40]。

图 1 3种指标的主成分散点图Fig. 1 Main dispersion point diagram of 3 indexes

根据主成分分值高低划分类型（图1），30株白腐菌可分为3种主要的降解类型：类型A包含选择性降解木质素的菌株，菌株的选择系数也越大，PC2分值也相应增高。类型B和C都代表选择性降解综纤维素的菌株，但B类型中的菌株对木质纤维素的降解能力极其微弱，C类型中的菌株对巨龙竹综纤维素和木质素的降解能力都较强，尤其对综纤维素的降解能力非常强烈，其降解的强烈程度反映在PC1的分值上，PC1分值越大的菌株则综纤维素降解率越高。图1显示SWFU 000072的PC1得分较低，PC2得分最高，其揭示该菌株择性降解木质素能力在30株白腐菌中最强。

2.3 紫外扫描分析结果

将选择性系数大于1的3个菌株SWFU 000072、SWFU 000013、SWFU 000086接种于过40目筛的巨龙竹粉，发酵20 d后用95%乙醇对的竹粉进行提取，对其提取液进行紫外光谱扫描，其紫外扫描光谱图（图2）表明空白对照组的在260 nm有明显的吸收峰，该吸收峰代表木质素中芳香环的吸收[41]；而其他组别在260 nm处无明显的吸收峰。

图 2 乙醇提取液的紫外光谱图Fig. 2 UV spectrum of ethanol extract

2.4 菌株鉴定结果

形态学鉴定结果：如图3a所示：担子果1年生，菌盖表面具粗毛和轮纹，菌肉异质；如图3b所示：子实层体初期为孔状，后期撕裂为齿状；如图4所示：菌丝系统三体系，生殖菌丝具索状联合，菌丝在Melzer试剂中无反应，在棉蓝试剂中无反应，在KOH试剂中无变化。

图 3 白腐真菌SWFU 000072担子果形态特征Fig. 3 Basidiomata of specimen SWFU 000072

图 4 白腐菌株SWFU 000072菌落形态Fig. 4 Colony characters of white rot fungi strain SWFU 000072

基于宏观生境特征（图3）、培养菌落性状及显微菌丝数据（图4），鉴定其为Cerrena属水平。

分子系统学鉴定结果：如图5所示，基于ITS序列构建的系统发育树表明，菌株SWFU 000072（GenBank no. MK809429）在系统发育树中与分子序列Dai 7 872、Dai 7 359、JXSB1742聚为一个支系，且具有高支持率（100% MP）。因此，该菌株鉴定为Cerrena zonata。

图 5 白腐菌株SWFU 000072系统发育树Fig. 5 The phylogenetic tree of white rot fungi strain SWFU 000072

3 结论与讨论

本研究从30株白腐真菌中筛选出1株高效降解巨龙竹木质素的菌株SWFU 000072，经过形态学与分子系统学鉴定为Cerrena zonata。基于主成分分析（PCA），揭示30株白腐菌存在3种降解类型：选择性降解木质素、选择性降解综纤维素、强烈地选择性降解综纤维素。通过对巨龙竹粉乙醇提取液进行紫外扫描分析表明木质素中的芳香环结构遭到了破坏，进而揭示了白腐菌通过破坏木质素中的芳香环结构完成高效降解巨龙竹木质素的降解机制。降解木材及农林废弃物木质素的真菌在国内外相继报道，如Ceriporiopsis subvermispora，Ganoderma australe，Lentinus edodes，Phanerochaete chrysosporium，Phlebia radiata，Pleurotus ostreatus，Stereum hirsutum，Trametes versicolor，其降解类型属白色腐朽[30,42-49]。本研究筛选菌株物种为Cerrena zonata，该种隶属于Cerrenaceae科，Polyporales目，与国内已报道多种林木腐朽真菌均为Polyporales目，表明该目物种在降解木材及农林废弃物木质素方面具有独特性，且该种为新整合种类[50]，为未来的深入研究提供了特殊材料。利用白腐真菌降解木质素研究结果揭示白腐菌在木材预处理阶段具有节约资源、减少污染物的排放、提高产能的优势[51-53]。王伟[54]从23株白腐真菌中筛选出3个高效降解黑杨木质素的物种，Funalia trogii，Trametes orientalis，Truncospora ochroleuca，并提出了3株白腐真菌降解黑杨的初步降解机制。本研究采用巨龙竹为研究对象，研究表明竹材失重率比木材失重率较低，分析其主要原因为竹材与木材木质素不同，竹材属于典型的禾草类木质素[28]。尽管真菌降解木质素已研究多年，但研究成果从实验室走到大田、生产车间还处在瓶颈期，从成果产出到实际转化、产生效益还有待继续开展深入研究和探索，尽管困难重重，始终坚信通过创新的、严谨的、科学的试验研究必定能开发出适合工业生产的高活性白腐菌株和培养体系，解决木质纤维素材料高效利用的瓶颈问题[27,29]。我国竹林面积居世界第一[55]，竹资源及其丰富，其孕育了竹资源加工利用及产业化高效快速发展的格局，但选择性去除竹材中的木质素极大地限制了竹资源深度利用，已成为竹生物制浆、竹纤维素制备、竹材综合开发与利用的卡脖子问题，因此如何高效且有选择性的去除竹材中木质素是一项集基础科学研究与产业应用转化于一体亟待解决的问题[28,56]。本研究尽管已筛选出高效降解巨龙竹白腐菌株，但是将其从实验室研究转移至产业应用转化还需要筛选出适应性较强的菌株。

随着化石资源枯竭，生物质资源利用研究日益突显。对于巨龙竹这种在制浆造纸、人造板材和生物炼制等工业领域表现出极高的研究开发价值的可再生资源开发利用刻不容缓[57]，竹木质素的去除还是一个未攻克的难题，由于工业制备纤维素材料时主要靠传统的高温高压、强碱法等方法去除木质素，这样不仅浪费大量的资源和能源也污染环境。本研究筛选出了能够选择性高效降解巨龙竹木质素白腐菌株并对其进行了鉴定，同时对其初步降解机制进行了揭示，为后续的研究提供一定的理论支持。在后续的研究中可选定木腐菌固体发酵培养基成分及培养条件；运用2个或以上菌株同时或先后培养来进行预处理，补足木腐菌在不同降解阶段的不同酶系，优化共生条件使其脱木质程度更高[54]。