20%氟唑菌酰胺·肟菌酯悬浮剂高效液相色谱分析

2022-04-11苏君一赵燕杰刘细平康占海

现代农药 2022年2期

苏君一，李敏，赵燕杰，徐妍，刘细平，陶婧，康占海*

（1.河北农业大学，河北保定 071000；2.北京宇悦生物科技有限公司，北京 100089）

氟唑菌酰胺（Fluxapyroxad），化学名称为3-(二氟甲基)-1-甲基-N-(3,4,5-三氟[1,1-联苯]-2-基)-1-吡唑-4-甲酰胺[1]，属于羧酰胺类杀菌剂，是巴斯夫公司研发的核心产品[2]。氟唑菌酰胺主要是通过利用抑制病原线粒体呼吸链复合体Ⅱ中琥珀酸脱氢酶的活性，从而进一步抑制病原菌孢子萌发及芽管和菌丝体的正常生长[3]。其作用方式不同于现有杀菌剂，同时又兼具普通杀菌剂所具有的广谱、高效等特点，已成为杀菌剂研究的新热点[4]。肟菌酯（Trifloxystrobin），又名肟草酯，化学名称为甲基(E)-甲氧基亚胺基-{(E)-α-[α,α,α-三氟-m-甲苯基)-亚乙基氨基氧基]-邻甲苯基}乙酸甲酯，属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂[5]，对真菌类病害如白粉病、锈病、颍枯病、稻瘟病等均具有良好的毒杀性能[6]。其主要作用于茎叶，同时有一定的治疗性能，有效成分对环境的影响可忽略不计，在孢子萌发和发病初期应用最佳[7]。

目前，国内关于氟唑菌酰胺、肟菌酯的高效液相色谱分析方法均有报道[8-9]，而这一混剂产品的同条件分析方法目前尚未见报道。基于这种现象，本研究采用高效液相色谱法，用C18反相柱和紫外检测器，对20%氟唑菌酰胺·肟菌酯进行分析和定量，此液相方法同时适用于氟唑菌酰胺和肟菌酯原药以及制剂的分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津Essentia LC-16型高效液相色谱仪装配有紫外可变波长检测器和自动进样器，岛津企业管理（中国）有限公司；乙腈（色谱纯），北京迈瑞达科技有限公司；氟唑菌酰胺标样（纯度≥99.0%）、肟菌酯标样（纯度≥99.0%）、20%氟唑菌酰胺·肟菌酯悬浮剂，北京宇悦生物科技有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 标样溶液的配制

分别称取0.021 0 g氟唑菌酰胺和0.021 4 g肟菌酯标准品，置于50 mL容量瓶中，用流动相溶解、定容后，过膜备用。

1.2.2 试样溶液的配制

称20%氟唑菌酰胺·肟菌酯悬浮剂样品0.201 4 g于50 mL的容量瓶中，用流动相溶解、定容后，过膜备用。

1.3 色谱条件

色谱柱是ZORBAX SB-C18不锈钢柱（250 mm×4.6mm，5μm）；检测波长：270 nm；流动相：乙腈-0.1%乙酸水（70∶30，V/V）；流速：1.0 mL/min；进样体积：10μL；柱温：30℃；保留时间：氟唑菌酰胺约4.6 min；肟菌酯约10.5 min。在以上色谱条件下，氟唑菌酰胺和肟菌酯标样和试样液相色谱图分别为图1、图2。

图1 氟唑菌酰胺和肟菌酯标样液相色谱图

图2 20%氟唑菌酰胺·肟菌酯悬浮剂试样液相色谱图

1.4 测定

在上述1.3色谱条件下待仪器基线稳定后，连续进样数针标准品溶液，直到相邻2针氟唑菌酰胺与肟菌酯峰面积的相对变化率小于1.5%时，按照标准品溶液、试样溶液、试样溶液、标准品溶液的顺序进行测定，用外标法计算氟唑菌酰胺及肟菌酯的含量。

1.5 计算

取2针平行标样和试样峰面积的平均值，按式（1）计算悬浮剂中2种有效成分的质量分数w，%。

式中：A1、A2分别为标样、试样峰面积平均值，mAU·min；m1、m2分别为标样、试样质量，g；P为标样含量质量比，%。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相的选择

选择合适的流动相是液相色谱分离效果的关键。分别以甲醇和乙酸水、乙腈和乙酸水为流动相对样品进行分离检测。根据检测结果，把乙腈和乙酸水作为流动相，出锋时间短，锋形尖锐，最终选定流动相的比例为V乙腈∶V0.1%乙酸水=70∶30。

2.1.2 检测波长的选择

通过紫外全波长扫描得到氟唑菌酰胺和肟菌酯相应的吸收波长和响应值。当波长为270 nm时，2种活性成分的吸收峰较强，杂质的响应值较小，因此检测波长为270 nm。

2.2 分析方法的线性相关性

按照系列稀释的方法配制5个不同质量浓度的氟唑菌酰胺及肟菌酯标准品溶液，在上面所述色谱分析条件进行测定，以质量浓度和峰面积为横、纵坐标绘制标准曲线。氟唑菌酰胺线为y=10 786x＋70 257，R2=0.999 7；肟菌酯为y=15 805x＋51 379，R2=0.999 7。二者R2均大于0.999，说明该方法线性关系良好。

2.3 分析方法的精密度

在选定的色谱操作条件下，对同一个20%氟唑菌酰胺·肟菌酯悬浮剂样品平行测定5次，计算氟唑菌酰胺和肟菌酯的标准偏差分别为0.040%和0.030%，变异系数分别为0.39%和0.30%（表1）。

表1 20%氟唑菌酰胺·肟菌酯悬浮剂精密度试验结果

2.4 分析方法的准确度

称取5个已知确定质量分数的20%氟唑·肟菌酯浮剂样品，每个样品都加入一定量的氟唑菌酰胺和肟菌酯标准品，按照选定的色谱条件测定样品中氟唑菌酰胺和肟菌酯的总质量，并计算其平均回收率。由表2可知，氟唑菌酰胺和肟菌酯的平均回收率分别是100.60%和100.14%。

表2 20%氟唑菌酰胺·肟菌酯悬浮剂回收率试验

2.5 非分析物干扰的分析

当我们在试验判定这种分析方法是否具有准确性时，还应包括非分析物质的干扰试验，有效成分中的任何干扰物都会导致分析方法出现系统误差。分析时应同时测定不含有效成分的空白样品，其证明样品没有被干扰。通过对溶剂、空白样品、原药等在1.3色谱条件进行分析溶剂及空白样品对分析无干扰，分离度高于1.5%，对有效成分的定性定量分析均无明显影响，所以本试验的分析方法未受到干扰。