不同材质的无菌采样拭子生物相容性研究

关键词：无菌采样拭子;医疗器械;细胞毒性;口腔刺激;皮肤致敏反应

【中图分类号】 R197.39 【文献标识码】 A       【文章编号】2107-2306（2022）06--06

Abstract： Objective To evaluate the effects of disposable sterile swabs of different materials on cytotoxicity， oral irritation and sensitization， and to provide safety basis and recommendations for disposable sterile swabs in the manufacture and application of medical devices. Methods In this study， disposable sterile swabs made of sponge， medical grade polyamide， and absorbent cotton produced by the same manufacturer were used to evaluate the results in cytotoxicity， oral irritation， and sensitization. In the cytotoxicity test， mouse fibroblast cells L-929 were used for the MTT detection of the extract to calculate the cell survival rate. Oral irritation tests were conducted using 0.9% sodium chloride injection and sesame oil extract samples， soaking cotton balls and stuffing them into the cheek pouch of the golden hamster， observing the erythema reaction on the surface of the cheek pouch， and taking the representative parts of the cheek pouch. Histological evaluation. For sensitization， samples were extracted with 0.9% sodium chloride injection and sesame oil， mixed with Freund’s complete adjuvant to form a stable emulsifier， and injected intracutaneously into the inner part of the scapula of each animal after the challenge. Observe the skin reaction of the sample group and the control group at the time of 24 hour and 48 hours. According to the Magnusson and Kligman grading standards， score the skin erythema and edema reaction of each challenge part. Results The cytotoxicity results showed that the disposable sterile swabs extracts of sponge， medical grade polyamide and absorbent cotton retained a normal appearance after 24 hours of incubation， and there was no significant difference. The MTT results were 83.6%， 80.8% and 84.4% respectively. In the oral irritation test， the oral skin and mucosal reaction of the test group of the three materials did not exceed the oral skin and mucosal reaction of the negative control group. In the sensitization reaction， the skin of the animals in the three groups of sample extract groups was intact， and there was no skin erythema and edema reaction.

Key words： Disposable sterile swabs; Medical device; Cytotoxicity; Oral irritation; Sensitization

一次性无菌采样拭子作为临床采集的重要工具，一般用于标本的采集和核酸的检验。特别是在2019年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）爆发后，为了人群的健康筛查，一次性无菌采样拭子的投入使用大幅提高。无菌采样拭子在应用时直接与被检测人的采样部位接触，因此，采样头材质对人体的生物相容性就尤为重要。如果使用劣质拭子，造成人体过敏或导致结果的假阴性，就会引发其他问题并延误患者的治疗。本研究选取同一厂家生产的三种不同材料的无菌采样拭子，通过细胞毒性[1]、口腔刺激和致敏反应试验[2]，评价不同材料的采样拭子的生物相容性，为无菌采样拭子在医疗器械制造以及应用方面提供安全依据和建议。

1 材料与方法

1.1材料 一次性无菌采样拭子（江苏华夏瑞泰医疗器械有限公司），小鼠成纤维细胞 L-929（美国菌种保存中心（ATCC）），MEM培养基（Hyclone），胎牛血清（Clark），青链霉素（Gibco）、，胰蛋白酶（biosharp），PBS（Gibco），MTT（Solarbio），异丙醇（Rhawn），高密度聚乙烯（Hatano Research Institute. FDSC），DMSO（Macklin），福尔马林固定液（国药集团化学试剂有限公司），苏木素染液（碧云天），尹红染色液（碧云天），盐酸酒精分化液（Phygene biotechnology Co.， Ltd.），二甲苯（上海凌峰），中性树胶（索莱宝），弗氏完全佐剂（SIGMA），十二烷基硫酸钠（SDS）（Solarbio），0.9 %氯化钠注射液（SC）（广西裕源药业有限公司），芝麻油（SO）（浙江田雨山药用油有限公司）

1.2仪器 CO2 培养箱（Thermofisher Scientific），电子天平（赛多利斯），洁净工作台（苏净安泰），低速自动平衡离心机（湖南湘仪），Multiskan™ Sky酶标仪（Thermofisher Scientific），倒置显微镜（含成像）（NIKON）、 立式单门双层恒温振荡箱（Crystal）

1.3实验动物 金黄地鼠6只，雌雄不限，健康、初成年、雌性未产且无孕，试验初体重100～120 g，来源于上海市松江区松联实验动物场，许可证号：SCXK（沪）2017-0008，每天供给江苏省协同医药生物工程责任有限公司的大小鼠维持饲料。另选30只（试验组20只、对照组10只）豚鼠（天竺鼠），雌雄不限，健康未使用过的动物，雌性未产且无孕，试验初体重：300.0～500.0 g，来源于无锡恒泰实验动物养殖有限公司，许可证号：SCXK（苏）2020-0003，每天供给江苏省协同医药生物工程责任有限公司的实验维持豚鼠饲料。饲养环境室温为18-26 ℃，相对湿度30 %-70 %。

1.4方法

1.4.1浸提液制备 将海绵、医用级聚酰胺以及脱脂棉制成的无菌采样拭子分别按照6 cm2/mL的比例浸没在含血清的培养基中，于37 ℃浸提24小时。另取三种材料的无菌采样拭子按同样的比例浸没于SC（极性浸提介质）和SO（非极性浸提介质）中，于50 ℃浸提72小时。

1.4.2细胞毒性试验 全程在超净台内操作，保证无菌操作过程。将生长至对数生长期的细胞用0.25%的胰蛋白酶（含EDTA）消化，消化后将细胞悬浮液离心（1000 rpm，5分钟），弃去上清，用MEM培养基重悬细胞，计数得到1×105个/mL 细胞悬液。将细胞悬液以每孔100 μl 接种于96孔板中，并在细胞培养箱（37 ℃，5% CO2，>90%湿度）中培养，镜下观察细胞形态。细胞培养板在孵育24小时后弃去孔内原培养基，在相应孔内各加入100 μl浸提液，空白对照（含血清培养基），阴性对照（按3cm2/mL浸提的高密度聚乙烯）和阳性对照（0.1% ZDEC），每组设置六个复孔。重新将96孔板置于细胞培养箱，培养24小时后取出，置于显微镜下观察细胞形态。形态学观察完毕后去除液体，在每孔中加入50 μl MTT液（终浓度为1 mg/mL），置于二氧化碳培养箱中培养。2小时后去除孔内液体，每孔加入100 μl 异丙醇溶解孔内形成的甲臢，用酶标仪在570 nm波长下测定每孔的吸光度值，计算其细胞毒性。细胞活力%=试验（或阳性及阴性）样品组OD570 /空白对照组OD570×100%。若细胞活力%<空白组的70%，说明样品具有潜在的细胞毒性。

1.4.3口腔刺激试验 将18只金黄地鼠依据不同材料的试验样品，按照完全随机分成极性浸提组和非极性浸提组，每组3只。翻转金黄地鼠颊囊用生理盐水冲洗后，检查有无异常。取样品浸提液浸透适宜大小的棉球，放入动物的一侧颊囊内，另一侧颊囊放入浸透同種浸提介质的棉球作为对照。接触时间为5 min，接触后除去棉球，用生理盐水冲洗颊囊，应注意不要污染另一侧颊囊。重复上述步骤每小时1次（±0.1 h），共4 h。按表1的记分系统，判断动物每一观察期颊囊表面红斑反应情况并记分，每一观察记分相加后再除以观察总数得出每只动物平均记分。取颊囊有代表性部位的组织样品放入10%福尔马林中固定后用显微镜进行组织学评价，可按表2规定的记分系统对每一组织进行评分，试验组平均记分减去阴性对照组平均记分得出刺激指数，见表3。

1.4.4皮肤致敏试验 85只豚鼠按照完全随机分成样品极性浸提组（三种材料每组10只）、样品非极性浸提组（三种材料每组10只）、极性溶剂对照组（5只）和非极性溶剂对照组（5只）、阳性对照组（2，4-二硝基氯苯（DNCB）10只）、阳性溶剂对照（（无水乙醇）5只）。皮内诱导阶段，在豚鼠去毛的肩胛骨内侧部位A、B、C三点成对注射0.1 mL配置的溶液。部位A：弗氏完全佐剂与选定的溶剂以50：50（V/V）比例混合的稳定性乳化剂。部位B：动物分别注射试验样品浸提液或阴性对照液。部位C：试验样品（部位B中采用的浓度），以50：50的体积比例与弗氏完全佐剂与溶剂（50%）配制成的乳化剂混合后进行皮内注射;对照组动物注射对照液与佐剂配制成的乳化剂。注射7天后去除每只动物的试验区被毛进行局部诱导，在激发前24小时用10% SDS处理。在注射部位将SDS按摩导入皮肤产生轻微的急性炎症反应。SDS处理后第2天，用纱布轻轻清除残留的SDS。试验组按部位B中选定的浓度，采用面积约8 cm2的敷贴片在新鲜制备的样品浸提液浸透后局部贴敷于每只动物的肩胛骨内侧部位，覆盖诱导注射点。用封闭式包扎带固定敷贴片，并于48小时后除去包扎带和敷贴片。激发前1天，去除动物一侧腹背部的被毛。于局部诱导阶段后14天，将吸收性纱布块置于试验样品浸提液和对照液中浸透，分别贴敷于每只动物的腹背部去毛区（诱导阶段未试验部位）。用封闭式包扎带固定，并于24小时后除去包扎带和敷贴片。除去样品后24小时和48小时，分别观察供试品组和对照组动物激发部位皮肤情况，在全光谱光线下观察皮肤反应，按Magnusson和Kligman分级标准对每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿进行描述并分级。如果对照组动物等级小于1，而试验组中等级大于或等于1时一般提示致敏。如对照组动物等级大于或等于1时，试验组动物反应超过对照组中最严重的反应则认为致敏。

1.5统计方法 数据表示为mean±SD，利用 Excel 软件对动物实验进行分组，分组方法采用完全随机设计。

2 结果

2.1细胞毒性试验 海绵、医用级聚酰胺以及脱脂棉制成的一次性无菌采样拭子在与细胞接触24小时后在显微镜下均可见胞浆内离散颖粒，无细胞溶解和细胞增殖下降情况，见图1。细胞存活率分别为83.0%，81.2%和84.2%，均大于70%，无潜在的细胞毒性，且各材料制成的无菌采样拭子在细胞毒性方面无显著性差异，见表4和图2。

皮肤致敏试验 除去样品后24和48小时，试验样品组与阴性对照组豚鼠均未出现死亡及其他异常情况，且各材料制成的无菌采样拭子均未导致皮肤红斑或水肿现象，动物皮肤完好，反应分级为0级，在致敏试验中没有皮肤致敏作用，见表8，图4。

3 讨论

医疗器械按照其与人体接触时间和接触性质可依据风险分为表面接触、外部接入和植入类的器械。一次性无菌采样拭子作为短期和粘膜进行接触的一类医疗器械在临床上应用十分广泛，一般用于流感等呼吸道及肠道病毒的鼻部及咽喉部采样，能够容易且舒适地将病人的脱落细胞提取出来，并可以完整、快速将采集患者病灶处的上皮脱落细胞脱离释放到细胞保存液中。同时，随着新型冠状病毒疫情的大爆发，通过鼻咽拭子标本进行病毒核酸检测是目前疫情防控的重要手段之一，能够更高效便捷地进行人群全面筛查。

由于一次性无菌采样拭子是直接与人体鼻咽部粘膜接触，其生物安全性的评价就尤为重要，而市面上制成无菌采样拭子的材料有许多种，包括海绵、人造丝拭子、植绒拭子、棉签等等。因此，本研究选取海绵、聚酰胺和脱脂棉三种材质的拭子，柄部均为ABS，观察不同材料的拭子对于生物相容性的影响。

《新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范》规定采样拭子宜选用聚酯、尼龙等非棉质、非藻酸钙材质的拭子，且柄部为非木质材料，折断点位于距拭子头顶端3cm左右，易于折断[3]。合成纤维棉签更适用与病毒采样，因为海藻酸钙拭子或木柄拭子可能含有使某些病毒失活并抑制PCR测试的物质，从而导致结果不准确[4]。尼龙植绒材质相比于棉签，柔软吸水性好，能够快速释放样本，易折断且方便运输保存。植绒拭子杆比较软，拭子头较细，相比于人造纤维材质的拭子更适合儿童鼻咽部的采集。此外，郭艳飞[5]发现相比于海棉拭子和棉签拭子，植绒拭子采样后具有更高的洗脱微生物效率，有利于表面微生物的收集。在本研究中，海棉拭子、聚酰胺拭子和脱脂棉拭子均无细胞毒性、口腔刺激性以及皮肤致敏反应，且三种材料结果相近。因此，不同材质的采样拭子均有良好的生物相容性，但如何選择因根据临床应用和实际情况进行决定。

参考文献：

[1]GB/T 16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验[S].2017.

[2]GB/T 16886.10-2017医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏试验[S].2017.

[3]新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范[J]. 中国病毒病杂志，2020，10（05）：330-332

[4]CDC： Coronavirus Disease 2019 （COVID-19）： Interim Guidelines for Collecting， Handling， and Testing Clinical Specimens from Persons Under Investigation （PUIs） for Coronavirus Disease 2019 （COVID-19）. CDC website. Updated March 9， 2020. Reviewed March 9， 2020. Accessed March 12， 2020.

[5]郭艳飞. 不同采样拭子材质和洗脱方式对表面微生物收集的影响[J]. 中国医药指南，2021，19（04）：24-26.

作者简介：王霄彤，1994年6月，女，江苏苏州，助理工程师，中检华通威国际检验（苏州）有限公司，医疗器械生物相容性检测