MTSS1可抑制鼻咽癌细胞的转移能力

蔡丰 徐露 徐洪波 周燕 汪庚明

摘要：目的研究MTSS1对鼻咽癌转移能力的影响;方法首先通过建立裸鼠鼻咽癌肺转移模型观察移植瘤与转移瘤中MTSS1的表达差异，进而在细胞水平通过transwell实验检测过表达MTSS1后细胞的侵袭转移能力改变;结果裸鼠实验发现MTSS1在肺转移瘤中的表达较移植瘤低，细胞实验发现过表达MTSS1后鼻咽癌细胞的转移能力降低;结论：MTSS1抑制鼻咽癌的侵袭转移，可抑制鼻咽癌细胞的转移能力。

关键词：MTSS1;鼻咽癌;裸鼠;肺转移模型

【中图分类号】 R766.3 【文献标识码】 A       【文章编号】2107-2306（2022）06--02

ABSTRACT：objective：to study the effect of MTSS1 on the metastasis of NPC and its possible mechanism.Methods：The expression of MTSS1 in the transplanted tumor and the metastatic tumor of NPC in nude mice was observed，at the cellular level，Transwell Assay was used to detect the expression of MTSS1 in lung metastatic tumors.Results：The expression of MTSS1 in lung metastatic tumors was lower than that in transplanted tumors in nude mice，conclusion：MTSS1 can inhibit the invasion and metastasis of NPC cells and inhibit the metastasis of NPC cells.

在我国，鼻咽癌是发病率最高的头颈部肿瘤之一，且死亡率高、预后差，患者确诊时多已发生的颈部淋巴结转移[1];因次，阐明导致鼻咽癌疾病进展和转移的机制至关重要[2]。MTSS1基因最初在转移性膀胱癌中被鉴定[3]，随后在食管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌中均被证实表达上调[4-6]。而在鼻咽癌中研究较少，故我们探索了MTSS1在鼻咽癌转移过程中的作用及可能的分子机制。

1 材料与方法：

1.1主要试剂

DMEM、胎牛血清购自HyClone公司，逆转录及PCR试剂盒购自Thermo scientific，qPCR试剂盒、嘌呤霉素购自广州复能基因，胰蛋白酶购自GIBCO公司，MTSS1基因引物、GADPH内参引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，MTSS1过表达载体由广州复能基因构建合成，脂质体2000（购自Invitrogen，USA），

1.2细胞株

人鼻咽癌细胞株SUNE1-6-10B购自中科院上海生命科学研究院

1.3裸鼠

BALB/c-nu雌性裸鼠，年龄8周，购于南京斯科瑞生物科技有限公司。合格证号：SCXK（苏）2011-0003

1.4裸鼠培养及成瘤模型建立

由BALB/cA近交系产生的BALB/c-nu裸鼠，胸腺未正常发育，抵抗力差，所以饲养环境要求较高，且易感染死亡，常用于研究肿瘤化疗药物。本实验的裸鼠食用的饲料、饮用水均通过高压蒸汽灭菌。

由于腋下血供丰富易于成瘤，注射操作相对简单易行，将总量为0.1ml的1×106/mL的鼻咽癌（SUNE1-6-10B）细胞株注射于裸鼠腋下。黄剑等[7]将鼻咽癌细胞接种于裸鼠皮下，并建立了自发性高淋巴道动物转移模型;韩春等[8]也用5-8F鼻咽癌细胞株成功建立肝转移动物模型。此方法已在多數学者的研究中用到。

将鼻咽癌上皮样细胞的浓度调整到1.0×106个/mL，用24号注射器皮下注射0.1 mL到8周龄大小无胸腺裸鼠的腋下组织，当裸鼠出现厌食、消瘦、腹水、活动能力下降等情况后处死。裸鼠处死后立即解剖取腋下移植瘤与肺组织的转移瘤常规固定和石蜡包埋，切片并对其进行HE染色，显微镜下观察肿瘤组织形态，确认为癌组织。

1.5免疫组化检测MTSS1在肺转移瘤与移植瘤中的表达

组织化学方法：采用EnVision法免疫组织化学技术行MTSS1染色。a石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3×3 min。0.3%H2O2抑制内源性过氧化物酶室温下20 min。PBS洗3×3 min。兔抗人MTSS1多克隆抗体工作浓度1：100 37℃1 h。PBS洗3×3min。Envsion试剂37℃30 min。PBS洗3×3min。DAB显色8～12 min。苏木素衬染，热水蓝化。吹干后，树脂封片后电镜下观察。

1.6过表达MTSS1的SUNE-1-5-8F细胞株建立

将50万个细胞接种于6孔板中，向每孔中加入含2ug慢病毒载体的脂质体2000（Invitrogen，USA），培养48小时后，加入终浓度为2ug/ml的嘌呤霉素培养2周，采用无线稀释法筛选出稳定抗嘌呤霉素的细胞株，然后常规培养于终浓度为2ug/ml的嘌呤霉素培养液中。

1.7 Transwell小室试验检测leti-MTSS1对鼻咽癌细胞侵袭能力的影响

实验中采用无血清的DMEM1∶4稀释Matrigel胶，取80μl平铺于Transwell小室的底部，在37℃的培养箱中培养30min后凝固成胶，取出培养的细胞，重悬细胞调整细胞浓度为50×104个/ml，取250μl接种于24孔板小室的上室中，下室加入含10%胎牛血清的培养液600μl。常规培养40h后取出小室，加入4%多聚甲醛固定20min，加入结晶紫30min后，轻轻擦去上室面的细胞，显微镜下分别取10个不同视野计数并拍照。

2.0统计学分析

计量资料数据均采用均数±标准差，采用SPSS19.0统计软件处理实验数据，两组数据比较采用t检验。使用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1、建立鼻咽癌裸鼠肺转移模型

肿瘤的转移模型可分为自发性两种转移模式与诱发性转移模式。此次实验使用的自发性转移模式，使用的浓度为1×106/mL的SUNE1-6-10B细胞株，每只裸鼠分别在腋下种植0.1ml的细胞。实验建模比较成功，成功率达66%。

3、RT-PCR比较肺转移灶与皮下移植瘤MTSS1mRNA的表达差异

肺转移灶组织和皮下移植瘤组织中均可在凝胶成像仪下见到扩增的MTSS1条带（288bp处），但肿瘤组织的较对照组组织稍清楚，并同时用电泳GAPDH内参（576bp处）和DNA标准分子量标记物（DNA Marker）作为参照和标尺。经过凝胶成像分析仪扫描后，对两种组织MTSS1mRNA/GAPDH电泳条带吸光度比值（mRNA水平相对值一目的条带吸光度值/内参GAPDH条带吸光度值），进行统计学分析，肺转移灶组织和皮下移植瘤组织的MTSS1mRNA表达量差异明显，具有统计学意义（P<0.05）。

4、我们通过transwell实验检测过表达MTSS1后SUNE-1-5-8F细胞的侵袭转移能力

Transwell小室实验的结果发现，在40h时，过表达MTSS1的细胞侵袭能力较对照组明显减弱（P<0.05），而正常组和阴性对照组细胞的侵袭能力变化无统计学意义（P>0.05）。

讨论

多项研究报道指出，MTSS1高表达可抑制肿瘤细胞的转移、侵袭，而低表达得患者预后差【9】。也有报道认为，MTSS1可使乳腺癌、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤转移和侵袭能力增强【10】。本实验，我们通过免疫蛋白印记分析和PCR研究发现，MTSS1基因的表达与鼻咽癌的转移和侵袭能力负相关。学者王艳良[11]等的研究显示，乳腺癌的转移、增殖等生物学功能受MTSS1的影响。学者杨波[12]等的研究显示，MTSS1在胃癌组织中表达下调，抑制胃癌细胞的侵袭和转移。

综上所述，MTSS1在鼻咽癌细胞中过表达，能够抑制鼻咽癌细胞的增殖和转移，本实验从分子水平探讨了鼻咽癌的发生及远处转移等相关问题，丰富了这一领域的相关文献，本实验结果均来自细胞培养，仍需下一步再体实验，为鼻咽癌的进一步研究提供新的方法和思路。

参考文献：

[1]CHEN YP，CHAN A T C，LE Q T，et al.Nasopharyngeal carcinoma[J].Lancet，2019，394（10192）：64-80.

[2]潘念基，張瑜，林少俊，等.1706例鼻咽癌放疗远期疗效分析[J].中华放射肿瘤学杂志，2008，17（4）：247-251.

[3]Lee，Y G，MACOSKA J A，KORENCHUK S，et al.MIM，a potential metastasis suppressor gene in bladder cancer.Neoplasia，2002，4（4）：291-294.

[4]XIE F，YE L，CHEN J，et al.The impact of Metastasis Suppressor-1，MTSS1，on oesophageal squamous cell carcinoma and its clinical significance[J].J Transl Med，2011，9（1）：95.

[5]黄剑，唐慰平，姚运红，等.人鼻咽癌自发性高淋巴道转移模型的建立及生物学特性研究.中华医学杂志.1998，78（10）：725.

[6]韩春，王爽，刘莉，等.鼻咽癌细胞肝转移亚株的建立.南方医科大学学报.2006，26（5）：654.

[7]LEE Y G，MACOSKA J A，KORENCHUK S，et al.MIM，a potential metaslasis suppressor gene in bladder cancer.Neoplasis，2002，4（4）：291-294.

[8]MERTZ K D，PATHRIA G，WAGNER C，et al.MTSS1 is a metastasis driver in a subset of human melanomas[J].Nat Commum，2014，5：3465.

[9]GIACOBBE A，COMPAGNONE M，BONGIORNO-BORBONE L.et al.p63 controls cel migration and invasion by transcriptional regulation of MTSS1[J].Oncogene，2016，35（12）：1602-1608.

[10]LING D J，CHEN Z S，LIAO Q D，et al.Differential effects of MTSS1 on invasion and proliferation in subtypes of non-small cell lung cancer cell[J].Exp Ther Med，2016，12（2）：1225-1231.

[11]王艳良，苏丽娅，刘铁刚，等.MTSS1在乳腺癌组织中的表达及其意义[J].包头医学院学报，2015，31（4）：16-17.

[12]杨波，何小彬，等.肿瘤转移抑制基因-1与肿瘤关系的研究进展[J].世界华人消化杂志，2014，22（34）：5291-5297.

项目名称蚌埠医学院自然科学基因面上项目（BYKY1777）