翻堆措施对传统堆肥理化指标及微生物种群的影响

王 博，安 昊，张婷婷，张 君，武生财，李焕春

（1.内蒙古自治区农牧业科学院资源环境与检测技术研究所，内蒙古呼和浩特 010031；2.五原县农牧业推广中心，内蒙古五原 015100）

早在公元前202年，我国就已经有了畜粪和农业废弃物进行发酵并用于农业生产的文字记载[1]，我国农村地区也有将秸秆、落叶、野草、动物粪便及垫圈料等农业废弃物通过堆沤的方式制成有机肥料的习惯[2]。但是，农业生产过程中偏施化肥会导致有机肥料施用比例逐年下降。偏施化肥不仅带来了众多环境污染问题，还导致耕地肥力不断下降[3-7]。发达国家采取了很多技术措施与政策鼓励将农业废弃物进行处理后用于农业生产，以解决化肥过量施用带来的环境污染问题[8]，其中好氧堆肥技术被广泛应用于农业废弃物高效处理与资源化利用领域。近年来，我国也不断出台关于耕地质量提升的相关政策，有机肥施用量在未来一段时间内将不断增加。据统计，我国每年产生各类农业废弃物约38 亿t[9]，有相当比例的农业废弃物仅采用了简单的晾晒、堆沤等方法进行处理。这些处理方法普遍发酵不彻底、发酵周期长，且处理后的产品存在质量不稳定、无害化程度低等问题[10]。中国农业大学2017年组织编撰的《中国有机肥企业调研报告》表明，目前，我国有机肥企业存在规模小、设施相对简陋、原料掺杂现象严重、产品质量低等问题。然而受限于我国有机肥行业的标准体系仍不完善及技术瓶颈难以突破，工厂化堆肥技术的产量与处理效率在短时间内无法迅速提高。因此，在未来的一段时间内，传统堆沤方式仍然是就近处理有机废弃物的主要技术与途径之一，改进传统堆沤技术与提高传统堆沤产品质量已成为急需解决的农业废弃物处理问题，目前关于堆肥工艺研究多集中于反应器或槽式堆肥工艺方面，针对传统堆沤技术与微生物种群的研究较少。本研究进行了在传统堆沤技术中增加翻堆措施的试验，旨在优化传统堆沤技术，提高传统堆沤肥料质量，为促进农村废弃物高效处理提供技术支撑，为耕地质量提升提供物质基础。

1 材料和方法

1.1 试验原料

试验周期60 d，采用奶牛粪与小麦秸秆为供试原料，原料性质见表1。

表1 试验原料性质

1.2 试验设计

将奶牛粪与小麦秸秆按3∶1 比例混合，初始含水率约为66%，堆体尺寸为5.0 m 长×2.0 m 宽×1.4 m高（图1），试验设4 个处理，详细设计见表2，所有处理设3 次重复。采用铲车进行物料混合与翻堆。

表2 试验处理设置

图1 堆体尺寸与堆肥现场俯视图

1.3 取样

堆肥发酵过程中进行取样检测，取样时间为堆肥第0、3、6、9、12、15、18、21、24、30、40、50、60 天；取样方法与测温方式见图2；取样时先将样品混合，然后采用四分法多次分取样品，共2 kg。样品分为3 份，1 份保存在4 ℃冰箱用于DNA 提取，测序样品保存于-80 ℃冰箱；1 份进行自然风干，粉碎后用于理化性质测定；1 份保存于-80 ℃冰箱待用。

图2 取样与测温方法

1.4 测定方法

温度采用感应探头（PT100，USA）测定；pH 值采用pH 测定仪（PHS-3C，中国）测定；EC 值采用电导仪（DDSJ-319L，中国）测定；全氮（TN）、有机质、水分及发芽指数指标参考《有机肥料》（NY/T 525—2021）方法测定。杂草种子灭活采用杂草种子发芽率测定：选用奶牛养殖饲料中常用的5 种牧草种子紫花苜蓿（豆科），菊苣（菊科），苏丹草（禾本科），黑麦草（禾本科，青贮饲料），籽粒苋（苋科）；耕地常见杂草种子1种：狗尾草（禾本科）。将上述6 种种子约500 粒装进孔度为0.15 mm 的尼龙网袋，将网袋放进肥堆的中心，并在网袋的扎口处系一条尼龙绳并引至在堆体外以方便种子采样。对照组（T1 与T2）在堆肥开始前将装有杂草种子的尼龙袋放入堆体中心，在第1、2、3、4、6、9、12、15、18、21、24、30 天取种子样品；试验组（T3 与T4）在堆体温度上升至40 ℃时，将装有杂草种子的尼龙袋放入堆体中心。在堆体温度达到40 ℃后的第12、24、36、48、60、72 小时取种子样品。每次取出35～40 粒种子测定发芽率[11]。堆肥样品总DNA 采用Soil Fast DNA 快速试剂盒提取（MP，Biomedicals，Santa Ana，Carlsbad，CA，United States），并进行Illumina HiSeq 高通量测序[12]。

1.5 数据分析

数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 24.0 统计软件进行数据分析，微生物种群丰度、多样性通过Galaxy 平台（http：//www.freebioinfo.org/）进行数据分析与作图（结果分析的序列要求为长度＞300 bp，没有不明确的碱基“N”，平均碱基质量得分＞30，最后生成每个样品的OTU 用于结果分析[13]）。

2 结果与分析

2.1 翻堆措施对堆肥过程理化指标的影响

在堆肥过程中，温度是反映有机物分解和微生物生长的重要因素。由图3a 可知，在采用翻堆措施后，试验组T3、T4 处理在第3 天至第21 天的温度均与对照组（T1 与T2）呈极显著差异（P＜0.01），T4 与T3 处理在第3 天至第21 天的温度无显著差异（P＞0.05）。T4 处理的堆体最高温度与升温速度高于对照组（T1 和T2），且高温期（≥55 ℃）持续时间得到延长。T4 处理最高温度可达到61.33 ℃，而T3 处理最高温度为56.67 ℃，对照组（T1 和T2）的最高温度仅为23.00 ℃和36.67 ℃。T4 和T3 处理的高温期（≥55 ℃）持续时间分别为9 d 和3 d，说明较高的翻堆频率能够提高堆体的最高温度与延长高温期持续时间。由图3b 可知，试验组（T3 和T4）的水分去除率分别达到33.84%和37.48%。对照组（T1 和T2）由于堆体温度较低，水分去除率仅为5.62%和20.64%。堆肥过程中所有处理的全氮含量呈现不同的变化趋势，由图3c 可知，试验组（T3 和T4）的全氮含量呈现下降趋势，对照组（T2）的全氮含量呈现上升趋势。由图3d 可知，堆肥过程中的有机质含量整体处于下降趋势，其中，T4 处理的有机质含量下降幅度最大，降幅达到39.81%；其次是T3 处理，降幅为31.15%；对照组（T1 和T2）的有机质含量没有明显降低，降幅仅为2.52%和2.96%。相关研究表明，EC 值高于4 ms/cm时，堆肥产物有可能具有植物毒性，并对作物生长产生影响，因此该堆肥产物不适用于制作成有机肥产品并进行农田施用[14]。由图3e 可知，经过60 d 发酵后，所有处理堆肥产物的EC 值未超过4 ms/cm，说明所有处理的堆肥产物不存在影响农业生产的隐患，T2 处理堆肥产物的EC 值显著（P<0.05）高于T1、T3 和T4 处理；与对照组相比，试验组的产物EC 值较低。堆肥过程中所有处理的pH 值变化规律相似，由图3f 可知，在堆肥开始的前9 d pH 值增加，然后开始下降，到堆肥第25 天左右开始波动。所有处理的堆肥产物pH 值均为7.8～8.3，T4 处理的最终pH 值为8.15。上述结果表明，翻堆措施能够提高堆体的最高温度，延长高温期持续时间，有效降低堆体水分含量，对大分子有机物具有良好的降解效果。

图3 堆肥过程中温度（a）、水分（b）、全氮（c）、有机质（d）、EC 值（e）及pH 值（f）变化规律

2.2 翻堆措施对堆肥过程腐熟度的影响

腐熟度是评价堆肥产物是否完成好氧发酵的重要指标，目前评价堆肥产物的腐熟度一般采用碳氮比与种子发芽指数两项指标[15-16]。由图4a 可知，经过60 d 发酵后，堆肥物料的C/N 整体呈下降趋势，试验组（T3 和T4）C/N 分别由初始的19.07 和15.50 下降至13.51 和10.55，基本达到了堆肥腐熟标准；而对照组T1 处理的C/N 下降较慢，堆肥结束后C/N为15.44。由图4b 可知，与对照组相比，试验组的发芽指数显著（P<0.05）提高，对照组（T1 和T2）的发芽指数相对较低，堆肥60 d 后发芽指数仍低于70%；而采用翻堆措施的试验组（T3 和T4）在发酵第30 天的发芽指数分别达到84.90%和73.32%。因此，翻堆措施对堆肥产品的腐熟度有积极影响。

图4 堆肥过程中C/N（a）和发芽指数（b）变化规律

2.3 翻堆措施对堆肥过程无害化程度的影响

杂草种子灭活率是衡量堆肥成品的安全限定指标，而堆体温度是降低杂草种子发芽率的有效措施[16]。研究表明，当堆体温度达到50 ℃并保持5 d 以上时，可以有效杀灭各种类型的杂草种子[11]。为了研究堆体温度在≥40 ℃条件时对杂草种子的灭活效果，本次试验设置了＜40 ℃（图5a）及≥40 ℃（图5b）两种堆体温度条件。由图5a 可知，在对照组（T1 与T2）中，由于堆体最高温度均未超过40 ℃，杂草种子在堆体温度＜40 ℃条件下未能实现100%的灭活，在堆体发酵进行到第28 天时，籽粒苋的发芽率仍然达到67.5%，狗尾草发芽率为9.2%，表明传统堆肥存在将杂草种子带入土壤的隐患[17]。由图5b 可知，与对照组相比，试验组的堆体温度在堆肥开始后第3 天即可达到≥40 ℃，在第6 天才达到50 ℃以上，而试验组在试验第5 天杂草种子发芽率为0。试验结果表明，翻堆措施能够通过提高堆体温度从而实现对堆体中杂草种子的灭活，且当堆体温度达到40 ℃以上并持续2 d 时，即可实现对杂草种子的全部灭活。

图5 不同温度条件下杂草种子发芽率

2.4 翻堆措施对堆肥过程微生物种群丰度及多样性的影响

堆肥中的微生物群落在调节堆肥过程与堆肥产品质量方面起到了重要作用[18]。对所有的堆肥样品进行16S rRNA 高通量测序得到微生物组数据。从156 个样本中共获得27 582 125 条16S rRNA 序列，每个样本有21 954 到789 581 个序列。这些序列分为3 254 184 个OTU（＞97%同一性）。由图6 可知，堆肥样品中大多数微生物物种在门水平上属于Bacteroidetes（拟杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Chloroflexi（绿湾菌门）、Euryarchaeota（广古菌门）和Deinococcus-Thermus（异常球菌-栖热菌门）。与对照组（T1）相比，翻堆措施能够提升Deinococcus-Thermus 的相对丰度，采用翻堆措施的条件下，T3 和T4 处理的相对丰度分别从1.52%和1.33% 提升到11.54%和12.48%，在堆肥开始后的第6 天，T4 处理的相对丰度提升至8.35%，而同期没有进行翻堆措施的对照组（T2）相对丰度仅为2.89%。Chloroflexi 的相对丰度也得到有效提高，T3 和T4 处理的相对丰度分别从1.98%和2.54% 提升到24.35%和19.54%。结果表明，采取翻堆措施的堆体中Deinococcus-Thermus 和Chloroflexi 的相对丰度较高。Chloroflexi的相对丰度增加，表明堆体中Chloroflexi 的微生物代谢活性持续增强，能够在堆肥升温期对不同类型的碳源进行降解，从而实现堆体的快速升温[19]。而Deinococcus-Thermus 能够在堆体进入高温期后继续对大分子有机物进行降解[20]。

图6 不同处理微生物种群丰度（门水平）

大多数微生物物种在纲水平上属于Gammaproteobacteria（γ 变形杆菌纲）、Actinobacteria（放线菌纲）、Bacteroidia（拟杆菌纲）、Flavobacteriia（黄小杆菌纲）、Clostridia（梭菌纲）、Anaerolineae（厌氧绳菌纲）、Bacilli（杆菌纲）、Deinococci（异常球菌纲）、Alphaproteobacteria（α 变形杆菌纲）和Methanomicrobia（甲烷微菌纲）等。由图7 可知，翻堆措施能够提高Deinococci 的相对丰度，T3 处理由1.12%提升至4.85%、T4 处理由0.89%提升至7.18%，而没有采用翻堆措施的T2 处理仅从0.38% 提升至2.14%。对照组T2 处理堆体中Methanomicrobia 的相对丰度较高，说明堆体内部出现了厌氧发酵，堆体会产生甲烷。上述结果表明，翻堆措施能够促进堆体中土著微生物的活性，从而促进土著微生物对大分子有机物的降解。

图7 不同处理微生物种群丰度（纲水平）

α 多样性指数通过比较不同处理的Shannon-Wiener、Inverted Simpson 和Pielous Eveness 指数确定堆体中土著微生物多样性[21]。由图8 可知，翻堆措施能够显著影响堆体中细菌α 多样性，4 个处理的细菌群落丰度、多样性和均匀度在整个堆肥周期中呈现出相同的趋势。添加辅料但不采取翻堆措施（T2）处理的微生物种群多样性和均匀度在堆肥过程中最高。在添加辅料的基础上采取翻堆措施（T3 和T4），会导致微生物细菌群落多样性有所下降，这是因为堆体温度的升高会降低中温与低温微生物的相对丰度，但与T1 处理相比，堆体中细菌微生物种群丰度、多样性和均匀度仍然得到提高。

图8 微生物细菌α 多样性

3 结论与讨论

本研究表明，在堆肥过程中采用原料配比与翻堆措施，对堆体的升温速度、高温持续时间、水分含量、全氮、有机质及发芽指数均产生了影响，与相关研究结果一致。堆肥开始时需调节初始物料C/N，适宜的C/N 能够有利于堆肥，一般情况下适宜的C/N范围为25∶1～30∶1[22]。但相关研究也表明，低C/N 物料（15∶1～20∶1）的堆体温度也可以达到60 ℃以上[23-25]，本研究物料的初始C/N 较低，通过在堆肥过程中采用翻堆措施实现对堆体的氧气补充，能够满足堆体内土著微生物对氧气的需求。堆体中土著微生物在对大分子有机物降解过程中会产生更多代谢热量，从而使低C/N 物料也能够快速升温与延长高温期持续时间[26]。翻堆措施还能够促进堆体的生物热能效率[27]，使堆体通过微生物代谢热快速去除水分[28]。同时，翻堆措施会提高堆体内微生物对不同类型有机物的降解能力，并消耗更多的氮源物质，从而导致堆肥过程中的全氮与有机质含量降低[29-30]。同时，堆肥产物实现腐熟是由于堆体内有机物经过微生物矿化和腐殖化达到稳定的结果，因此腐熟度较高的堆肥产物会提高发芽指数[31]。而传统堆沤由于堆体结构较差，并且没有为堆体补充氧气，导致堆体内微生物活性较低，从而使堆体无法升温、水分去除效率低、全氮含量较高、有机质降解效率及发芽指数较低。

研究表明，好氧发酵在不同阶段的优势微生物种群是不同的，随着堆体进入高温期，Deinococci 的相对丰度得到增加，这类微生物通常在堆肥的高温阶段发现[32]，高温期堆体提高了嗜热微生物的丰度与活性，增强了嗜热微生物代谢功能，减少了低温或中温微生物的相对丰度，使堆体在高温期能够继续对有机物进行降解，但堆体中细菌多样性也会降低[33]。然而，采用翻堆措施的堆体中仍然存在Anaerolineae，说明即使采取了原料配比与翻堆措施，堆体中仍存在局部厌氧发酵的现象。

本研究表明，目前对照组没有高温发酵过程，发芽指数较低，同时微生物组成中厌氧微生物相对丰度较高。而采用较高翻堆频率的试验组能够提高堆体的最高温度并延长高温期持续时间，有利于去除堆体中的水分，降低堆肥成品中全氮和有机质含量，提高堆肥成品的腐熟度（发芽指数为77.11%，C/N 降低至10.55）及无害化程度（杂草种子发芽率为0），以及改变堆体中细菌种群组成，降低堆体中细菌种群多样性，增加嗜热菌的相对丰度，使堆肥产品能够满足《畜禽粪便堆肥技术规范》（NY/T 3442—2019）的要求。