超高效液相色谱-串联质谱法同时测定畜禽粪便中34 种抗生素含量

韩岩松，郑 锌，黄均明，保万魁，刘红芳，刘 蜜，王 旭*

［1．中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081；2．岛津企业管理（中国）有限公司北京分公司，北京 100020］

目前，中国是全球最大的抗生素生产国和消费国，同时也是全球细菌耐药最严重的国家之一［1］。据统计，国内抗生素每年总产量大约为21 万t，消费量约18 万t，其中用于畜牧及饲料行业的抗生素就有60 多种，高达9.7 万t，约占消费总量的54%［2-3］。畜禽摄入的抗生素有30%～90%以原药或代谢产物的形式排出体外，2013 年中国畜禽养殖使用抗生素总量接近10 万t，估计畜禽排泄的抗生素达到5 万多t［4-5］。排泄的抗生素随着粪便进入农田［6］，导致土壤抗生素污染［7］，且土壤中多种抗生素会产生加和、协同、拮抗等交互作用，对土壤中的植物、动物、微生物产生的复合污染毒性效应，导致土壤中多种抗生素复合污染［8-11］。在畜禽粪便肥料化利用过程中，抗生素会被不同程度地降解或消减。堆肥化处理技术通过生物作用和非生物作用实现抗生素的有效降解，是目前畜禽粪便无害化和资源化处理的主要方式，包括好氧堆肥、高温堆肥及厌氧消化3 种［12-23］。

有研究表明，磺胺类、四环素类和喹诺酮类抗生素是畜禽养殖中最为常用的几类抗生素，这些饲用抗生素若随排泄物进入农田后，可被长期累积，进而对耕地质量、农产品安全、人类和动物健康等造成很大危害［24-33］。然而，目前我国畜禽粪污中抗生素的检测标准相当薄弱，部分研究只针对四环素类及大环内酯类含量进行检测，而对磺胺类、喹诺酮类的测定近乎空白［34-40］。抗生素的检测方法有微生物法［41-42］、生物传感法［43-44］、酶联免疫法［45-48］、液 相 色 谱 法［49-53］、液 相 色 谱-质 谱法［54-59］等。其中，微生物法和生物传感法操作简单、检测效率高、成本低，但特异性差、灵敏度较低；酶联免疫法前处理简单、灵敏度高、分析速度快，但检测结果会出现假阳性现象；液相色谱法存在分析时间长、检出限高等缺点；相比之下，液相色谱-质谱法（尤其是液相色谱-串联质谱法）具有选择性强、灵敏度和准确性高等优点，特别适合基体复杂、抗生素含量低的样品分析，现已成为抗生素的主流检测方法。根据畜禽粪便样品基体复杂等特点，建立液相色谱-串联质谱法联合测定方法研究有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂

所用试剂和溶液的配制，在未注明规格和配制方法时，均应按HG/T 3696 规定执行。超高效液相色谱-串联质谱法用水为超纯水。

甲醇：色谱纯。乙腈：色谱纯。正己烷：色谱纯。盐酸：优级纯。氢氧化钠：分析纯。

氢氧化钠溶液：c（NaOH）= 0.01 mol/L。

磷酸氢二钠溶液：c（Na2HPO4）= 0.2 mol/L。柠檬酸溶液：c（C6H8O7）= 0.1 mol/L。

Mcllvaine 溶液：将磷酸氢二钠溶液与柠檬酸溶液按体积比5∶8 混合。

Na2EDTA-Mcllvaine 提 取 液：c（Na2EDTAMcllvaine）= 0.1 mol/L。称取37.2 g 二水乙二胺四乙酸 二 钠（Na2EDTA·2H2O）于1 L Mcllvaine 溶 液中，用HCl 或NaOH 调至pH 值为4.0。

甲醇溶液：φ（CH3OH）=15%。甲醇溶液：φ（CH3OH）=65%。

磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺噻唑（STZ）、磺胺吡啶（SPD）、磺胺甲基嘧啶（SM1）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺甲噻二唑（SMT）、磺胺对甲氧嘧啶（SMD）、磺胺氯哒嗪（SCP）、磺胺甲氧哒嗪（SMP）、磺胺邻二甲氧嘧啶（SDM′）、磺胺间二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺甲基异噁唑（SMZ）、磺胺二甲基异噁唑（SIZ）、苯甲酰磺胺（SB）、磺胺喹恶啉（SQ）、磺胺醋酰（SAA）、甲氧苄氨嘧啶（TMP）、磺胺苯吡唑（SPA）、金霉素（CTE）、四环素（TCY）、土霉素（OXY）、强力霉素（DOX）、依诺沙星（ENX）、氧氟沙星（OFX）、诺氟沙星（NOR）、培氟沙星（PEF）、环丙沙星（CIP）、洛美沙星（LOM）、达氟沙星（DAN）、恩诺沙星（ENF）、沙拉沙星（SAR）、双氟沙星（DIF）、司帕沙星（SPX）单标储备液：ρ= 100 mg/L。（购买经国家认证并授予标准物质证书的标准溶液物质，有效期2 个月）

34 种混合标准溶液：ρ= 1 mg/L。分别吸取单标储备液0.1 至10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，于-20℃避光保存，有效期为1 周。

1.2 仪器

超高效液相色谱-串联质谱仪（LCMS-8045，日本岛津）；冷冻干燥机（德国Christ Beta 2-8 LD plus）；漩涡混合器（艾卡IKA-MS3）；超声波清洗机（YUYI）；离心机（8000 r/min）；旋转蒸发仪（步琦BUCHI R-100）；固相萃取装置；HLB 固相萃取柱：500 mg；电子天平（精度0.0001 g）。

1.3 供试样品

样品来源于收集的牛粪、羊粪、猪粪、鸡粪以及肥料样品共若干个（表1）。

表1 供试样品信息

1.4 样品前处理

本方法采用甲醇、Na2EDTA-Mcllvaine 提取液各10 mL 分2 次 提 取，超 声10 min、离 心5 min，固相萃取流速3 ～5 mL/min 提取畜禽粪便中的抗生素。

1.4.1 试样的制备

样品经冷冻干燥后，缩分至约100 g，迅速研磨至全部通过0.5 mm 孔径试验筛（如样品潮湿，可通过1.00 mm 试验筛），混合均匀，置于洁净、干燥容器中，-20℃以下保存备用。

1.4.2 试样溶液的制备

称取试样0.5 ～1 g（精确至0.0001 g）置于50 mL 离心管中，加入Na2EDTA-Mcllvaine 提取液10 mL，涡旋混匀，再加入10 mL 甲醇，涡旋混匀，常温超声提取10 min，在4 ℃下8000 r/min 离心5 min，上清液转移至棕色分液漏斗，固体部分重复提取一次，合并提取液，加入10 mL 正己烷去脂后，下层滤液过0.45 μm 微孔滤膜，将过膜后液体在旋转蒸发仪（水浴温度不超过40℃为宜）旋蒸至3 ～5 mL，用于净化。

HLB 固相萃取柱使用前依次用5 mL 甲醇和5 mL 水活化。将以上提取液以3 ～5 mL/min 流速过柱，用5 mL 的15%甲醇溶液淋洗HLB 固相萃取柱并抽干，用10 mL 的65%甲醇溶液洗脱目标抗生素，洗脱液于旋转蒸发仪旋蒸至近干，用流动相定容至1 mL，过0.22 μm 膜，上机待测。

1.5 仪器条件

1.5.1 液相色谱参考条件

色 谱 柱：Shim-pack GIST，2 μm，（2.1×100）mm，或者相当；流动相：由0.1%甲酸溶液（A）与乙腈（B）组成，梯度洗脱程序见表2。流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。

1.5.2 质谱参考条件

表2 梯度洗脱程序

离子化模式：电喷雾电离（ESI），正离子模式；接口电压：4500 V；雾化气：氮气3.0 L/min；干燥气：氮气10 L/min；加热气：空气10 L/min；碰撞气：氩气；DL 温度：250℃；加热模块温度：400℃；接口温度：300℃；扫描模式：多反应监测（MRM）模式，MRM 参数见表3；驻留时间：5 ms；延迟时间：3 ms。对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。

1.6 基质匹配混合标准曲线的绘制

取若干份空白试样，按1.4.2 步骤处理与净化。然后用该空白试样溶液和混合标准溶液配制成浓度为10 ～200 μg/L 基质匹配的混合标准系列溶液，供液相色谱-串联质谱分析测定。该系列溶液需临用现配。按浓度由低到高进样检测，以标准系列溶液质量浓度（μg/L）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。可根据不同仪器灵敏度或样品含量调整标准系列溶液的质量浓度。

1.7 试样溶液的测定

1.7.1 定性

在色谱质谱条件下，分别对基质匹配的混合标准系列溶液和试样溶液进行测定，34 种目标抗生素质谱选择离子参数见表3。

表3 34 种抗生素MRM 优化参数表

表3（续）

在相同实验条件下进行样品测定时，如果检出色谱峰的保留时间与标准样品相一致，偏差在2.5%之内；并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子丰度与标准样品的离子丰度相一致，偏差不超过表4 规定的范围，则可判定为样品中存在该抗生素。

1.7.2 定量

表4 定性分析时相对离子丰度的最大允许相对偏差

采用基质匹配标准曲线校准、外标法定量。34种抗生素的基质匹配标准曲线的相关系数应不小于0.99。所测样品中抗生素的响应值应均在该标准曲线的线性范围内。若超出该线性范围，则需减少试样量重新实验或将试样溶液和基质匹配标准溶液做相应稀释后重新测定。

2 结果与分析

2.1 实验条件的确立

针对样品前处理条件的优化，分别考察了鲜羊粪、鲜牛粪、鲜猪粪、鲜鸡粪、处理猪粪及处理鸡粪样品所需提取剂用量及提取次数、超声时间及离心时间、固相萃取时液体流速对结果的影响。

2.1.1 抗生素提取剂用量及提取次数优化

实验采用甲醇、Na2EDTA-Mcllvaine 提取液各5 mL 分2、3 次提取与各10 mL 分2 次对S1 ～S6空白基质样品进行提取实验。空白基质样品加标量为50 μg/L，每个样品进行两次平行测定，处理猪粪结果见图1。

图1 S4 空白基质34 种抗生素提取剂用量及提取次数优化试验

结果显示，在S4 空白样品中，采用甲醇、Na2EDTA-Mcllvaine 提取液各10 mL 分2 次提取是抗生素的最佳提取次数。对S1、S2、S3、S5、S6空白样品进行了同条件验证，验证结果与图1 结果相吻合。

2.1.2 提取方式的选择

实验分别考察了超声10、15 min，离心5、10 min 2 个时间点，试样提取液固相萃取流速1、3 及5 mL/min 3 个时间点。各基质空白样品加标量为50 μg/L，进行两次平行测定，S4 空白样品结果见图2、3。

结果显示，在S4 空白样品中34 种抗生素药物的提取，选择超声10 min、离心5 min，固相萃取流速3 ～5 mL/min 是抗生素提取的最佳条件，同条件也适合S1、S2、S3、S5、S6 空白样品。

2.2 基质匹配回归方程、线性范围和检出限

用各基质的空白试样溶液和全混合标准工作溶液配制成浓度为0.5 ～200 μg/L 基质匹配的混合标准系列溶液。在所选择的最佳实验条件下进行测定，得到回归方程、线性范围和相关系数见表5、6。

图2 S4 空白基质34 种抗生素提取方式的选择

图3 S4 空白基质34 种抗生素提取液固相萃取流速的确立

表5 S1 ～S3 基质中34 种抗生素线性范围及相关系数

（续表）

表6 S4 ～S6 基质中34 种抗生素线性范围及相关系数

（续表）

表5、6 结果显示，在液质联用色谱法中，各基质中磺胺类在0.5 ～200 μg/L 范围内具有良好的线性关系；在S1 和S2 基质中，喹诺酮类及四环素类在0.5 ～200 μg/L 范围内具有良好的线性关系；在S3、S4、S5 及S6 样品基质中，喹诺酮类及四环素类在1 ～200 μg/L 范围内具有良好的线性关系。

用各基质空白样品添加34 种混合抗生素浓度为0.2、0.5、1、2、5 μg/L，用上述前处理方法进行样品处理，依照确定的色谱和质谱条件进行分析，进样5 μL，进样次数10 次，用噪音理论确定34 种抗生素的检出限（3 倍信噪比）和定量限（10 倍信噪比）。本方法6 种基质中34 种抗生素检出限为0.5 ～2.0 μg/kg，定量限为2.0 ～5.0 μg/kg。

2.3 精密度实验

为考察超高效液相色谱-串联质谱法的精密度，对各基质进行添加回收实验，添加量为20、50、100 μg/kg，每个添加量平行测定6 次，连续重复测定3 d，考察批内和批间重复性。采用已建立的方法进行测定，各基质中34 种抗生素含量见表7。结果表明各空白基质方法批内变异系数、批间变异系数均不超过25%。

表7 各基质中34 种抗生素含量 （μg/kg）

（续表）

2.4 准确度实验

通过加标回收实验来评价超高效液相色谱-串联质谱法的准确性。在S1 ～S6 基质样品中，加入定量的34 种抗生素标准溶液。经两次平行测定，统计本方法的回收率，基质样品本底值见表7。方法对各基质样品中的34 种抗生素回收率均在64.6%～117.9%之间（表8 ～10）。

2.5 10 μg/L 标准溶液中34 种抗生素色谱图

采用超高效液相色谱-串联质谱仪（LCMS-8045，日本岛津）测定10 μg/L 标准溶液中34 种抗生素色谱图（图4）。

表8 各基质中34 种抗生素含量回收率（加标量为20 μg/kg） （%）

表9 各基质中34 种抗生素含量回收率（加标量为50 μg/kg） （%）

表10 各基质中34 种抗生素含量回收率（加标量为100 μg/kg） （%）

图4 10 μg/L 标准溶液中34 种抗生素色谱图

3 结论

建立了同时测定畜禽粪便中34 种抗生素含量的超高效液相色谱-串联质谱法，并对该方法的样品前处理条件、稳定性、准确性、可靠性等参数进行了研究。结果显示，这种方法的精密度、准确性等方法性能指标均能满足检验的要求，适合畜禽粪便中抗生素的检测。方法的建立将进一步为以畜禽粪便为原料加工成肥料产品的质量监督和市场监管提供技术支撑，从而有效地降低农产品与耕地污染风险，保护生态环境。