双歧杆菌制剂对大鼠肿瘤模型化疗引起肠道炎症的影响

潘 捷，段达荣

（台州市第一人民医院医学门诊部1，检验科2，浙江 台州 318020）

化学药物疗法（chemotherapy）是肿瘤常用的治疗方法之一，随着该方法的广泛使用和疗效的提高，使得肿瘤患者的寿命大大延长；而化疗药物可诱发肠道黏膜的微炎症，造成肠道屏障功能破坏、肠道通透性增加等改变，临床上表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻等不良反应，进而肠道细菌穿过肠道屏障进入血流，引起严重的血流感染，从而影响到治疗的进程，甚至危及患者生命[1-3]。有研究显示[4，5]，化疗期间补充双歧杆菌可能减轻肠道黏膜微炎症，双歧杆菌所产生的短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）类物质可明显减轻患者体内的结肠炎及化疗诱导的肠道黏膜微炎症反应，降低化疗患者血流感染的发生率。本研究在对SD 大鼠肿瘤应用氟尿嘧啶治疗过程中加入不同剂量的双歧杆菌，观察大鼠肠道炎症指标的变化，以明确双歧杆菌对减少氟尿嘧啶化疗过程中发生血流感染的价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择健康SD 大鼠24 只，重量160～180 g，由温州医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYLK（浙）2015-0008。实验方案经实验动物伦理委员会批准，实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其痛苦和死亡。

1.2 试剂与仪器 双歧杆菌制剂采用酪酸梭菌双歧杆菌二联活菌（商品名：常乐康，山东科兴生物制品有限公司，批号：S20190015，规格：500 mg/袋）；氟尿嘧啶主要作用成份为5-氟尿嘧啶（海南中化联合制药工业股份有限公司，批号：1904221，规格：0.5 g/支）；粪便隐血（OB）试剂盒（匹拉米酮半定量检测法，中国珠海贝索生物技术有限公司，批号：B190402）；革兰染色液（中国珠海贝索生物技术有限公司，批号：A190301）、肠组织髓过氧化物酶（MPO）（美国R&D公司，批号：19082101），促炎因子NF-κB（美国Santa Cruz 公司，批号：191106），H22 肿瘤细胞（购自中科院细胞研究所）；酶标仪（瑞士帝肯公司，型号：TECAN HB-150E）；显微镜（日本OLYMPUS 型号：CX31）。

1.3 动物肿瘤模型的建立及相关指标的检测 取H22肿瘤细胞，3000 r/min 离心5 min，再用生理盐水洗3次，并做适当稀释。取40 μl 细胞悬液加入10 μl 0.4%溴酚蓝染色并镜检计数，并制成3×106个/ml 肿瘤细胞悬液，分别给予SD 大鼠右腋皮下接种肿瘤细胞悬液0.2 ml。接种完成后，逐日进行观察，如果出现肿瘤迅速增长，符合大鼠肿瘤模型。将符合大鼠肿瘤模型的大鼠分为A、B、C、D 4组，每组6 只。A组作为对照，B组给予氟尿嘧啶，C组给予氟尿嘧啶+低剂量双歧杆菌，D组给予氟尿嘧啶+高剂量双歧杆菌。氟尿嘧啶按10 mg/（kg·d）喂量，低剂量双歧杆菌按10 mg/（kg·d）喂量，高剂量双歧杆菌按50 mg/（kg·d）喂量，对照组不使用氟尿嘧啶或双歧杆菌喂养。每日观察大鼠的体重、活动、饮食情况及粪便隐血情况，并对粪便进行革兰染色评估，判断革兰阳性菌及革兰阴性菌。连续7 d 后对大鼠进行注射麻醉解剖，观察肠道充血、水肿、溃疡情况，检测MPO、NF-κB 活性。

1.4 检测指标及赋值 MPO、NF-κB的检测方法参照试剂使用说明书进行，对肠组织进行冷冻切片，进行HE 染色，HE 染色过程参照相关操作规程进行，粪便革兰染色过程参照相关操作规程进行，球菌与杆菌比值按比值计算。粪便隐血采用匹拉米酮半定量检测法，判读阴性、1+、2+、3+、4+，并分别赋值0、1、2、3、4。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析。计量资料用（±s）表示，两组间独立样本采用t检验，计数资料采用[n（%）]表示，行x2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠相关检测指标情况 B、C、D组大鼠体重均小于A组，差异有统计学意义（P＜0.05），但D组大鼠体重高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组粪便细菌染色的球杆比高于A组，D组粪便细菌染色的球杆比高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组粪便隐血、肠组织MPO 和NF-κB 低于B、C、D组，B组隐血、MPO 和NF-κB 低于C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠相关检测指标情况（±s）

表1 各组大鼠相关检测指标情况（±s）

注：与A组比较，aP＜0.05；与B组比较，bP＜0.05；与C组比较，cP＜0.05

组别A组B组C组D组体重（g）178.61±5.03 160.14±6.78a 166.47±3.86a 169.52±3.83ab球杆比0.41±0.14 2.27±0.33a 2.21±0.49a 0.91±0.13abc隐血0.24±0.13 3.47±0.52a 1.26±1.48ab 1.12±1.04ab MPO 19.62±2.08 76.34±8.21a 76.18±8.13a 53.51±5.25abc NF-κB 1.49±0.90 8.94±1.52a 8.31±0.54a 5.24±0.69abc

2.2 各组大鼠肠组织HE 染色情况 对大鼠肠组织进行HE 染色发现，A组无明显炎性细胞浸润，基本正常结肠组织结构；B组肠组织的黏膜、黏膜下炎症细胞重度浸润；C组黏膜下层炎症明显细胞浸润，腺体减少；D组黏膜下轻度炎症细胞浸润，见图1。

图1 各组大鼠肠组织HE 染色（×200）

3 讨论

人体肠道上皮细胞内含有特殊的耐受性树突状细胞、巨噬细胞和调节性T 细胞，这些免疫细胞可以产生许多抗炎细胞因子，从而下调炎症反应，维持肠道内环境的稳定[6，7]。肠道内正常菌群或其代谢产物可通过与肠上皮细胞表面的Toll 样受体（toll-likereceptors，TLR）结合，启动下游炎症反应因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6 等），维持肠道内环境的稳定[8，9]。一些药物（特别是化疗药物）的使用可改变这种稳定状态，化疗期间肠道黏膜微炎症的发生与肠道菌群及其代谢产物的变化密切相关，肠道菌群可发生改变[10]，而这些改变的菌群会合成多种代谢产物，这些产物在肿瘤的发生和发展过程中发挥了作用，不利于肿瘤的治疗。Konishi H 等[11]研究指出，肠道共生菌，特别是双歧杆菌、梭状杆菌等革兰阴性益生菌能够改变肿瘤微环境，明显减轻患者体内的结肠炎及化疗诱导的肠道黏膜微炎症反应[12]。如果在化疗过程中加入大量双歧杆菌等益生菌，可以提高机体对于寡核苷酸介导的肿瘤治疗和铂类化疗的疗效，有效降低化疗血流感染风险，提高治疗成功率[13]。

氟尿嘧啶是目前临床上应用最广的抗嘧啶类药物，对消化道癌及其他实体瘤有良好疗效，在肿瘤治疗中占有重要地位，是一种常见的肿瘤化疗药物。氟尿嘧啶主要通过酶将其转化为5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸，5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成[14]。此外，氟尿嘧啶的代谢物也可以以代谢物的形式掺入到RNA 和DNA 中，影响细胞功能，产生细胞毒性，但其对肿瘤细胞作用的同时也会对正常细胞产生影响[15]。

MPO 是中性粒细胞的重要组成部分，是炎症和组织损伤的重要指标。研究发现[16，17]，实验性动物和炎症性肠炎的MPO 活性增加，提示肠道炎症发生。本研究结果显示，采用氟尿嘧啶治疗大鼠肠道肿瘤过程中MPO 活性明显增强，说明双歧杆菌能有效缓解肿瘤化疗过程中对肠道上皮细胞的炎性损伤；同时，增加双歧杆菌制剂的剂量后MPO 活性降低，说明双歧杆菌有助于减少肠道炎症的发生。部分研究发现[18，19]，对有肠道肿瘤的实验大鼠进行氟尿嘧啶单药化疗的过程当中，其肠道菌群的总数在化疗期间明显减低，特别是双歧杆菌、梭状杆菌集落Ⅳ及梭状杆菌集落ⅪVa 等有益菌株的数量下降明显。这种肠道微生态的改变更有利于致病菌的生长，增加化疗诱导腹泻等毒副反应的发生率，增加血流感染的风险。本研究显示，化疗会导致大鼠肠道菌群中球菌与杆菌比例倒置，影响菌群平衡，不利于肿瘤的治疗，而加入双歧杆菌会改善这一状况，与报道结果基本一致[20，21]。促炎因子NF-κB 可以激活细胞因子、趋化因子等炎症介质的表达[22]，参与结肠炎及其它肠道炎症的表达。NF-κB的活性可反映炎症的严重程度。研究发现[23，24]，使用化疗药对动物模型进行干预会导致NF-κB的活性加强，引起肠道炎性感染，最终导致治疗失败。本研究显示，化疗药物治疗后大鼠肠道NF-κB的活性大幅增加，但在加入大剂量的双歧杆菌后NF-κB的活性降低；而从HE 染色的炎症细胞浸润程度也可以得出同样的结果，进一步证实了双歧杆菌的作用。

综上所述，化疗可以导致肠道内环境改变，诱导肠道炎性发生，导致治疗的失败。而在肿瘤化疗过程中加入大剂量的双歧杆菌制剂可以减少肠道炎症和血流感染的风险，提高治疗成功率。