基于铁死亡的纳米联合疗法在恶性肿瘤治疗中的研究进展

王钦 刘军杰 陆秀鑫 吴雅菲 综述 张文皓 审校

恶性肿瘤长期严重威胁人类的健康与生命，其发病率逐年上升[1]。近年来，新兴的生物医学发展和技术创新为恶性肿瘤的治疗提供了更多可能。其中，诱导肿瘤细胞铁死亡(Ferroptosis)是最具代表性的抗肿瘤策略[2-4]。此外，随着纳米技术和生物材料技术的蓬勃发展，纳米制剂介导的新型无创治疗策略在肿瘤诊断与治疗上表现出巨大的前景。纳米制剂可由血液运输直接递送并聚集于肿瘤病灶区域，为精准靶向的非侵入肿瘤治疗提供了可能。纳米制剂既可以将肿瘤内源性物质作为底物驱动催化反应，来调节其微环境以达到抗肿瘤的效果；又可以靶向递送和可控缓释临床化疗药物，实现了恶性肿瘤的位点特异性治疗。研究表明，纳米制剂可特异性诱导肿瘤细胞发生铁死亡[5]。因此，纳米制剂介导的铁死亡抗肿瘤疗法的研究呈现出指数级的增长。本文就纳米制剂诱导的铁死亡作用机制及基于铁死亡的联合抗肿瘤疗法的最新研究进展进行综述，并总结了铁死亡疗法在临床肿瘤治疗中的应用前景与挑战。

1 纳米制剂介导的肿瘤细胞铁死亡作用机制

1.1 纳米制剂促进肿瘤细胞内芬顿反应

肿瘤细胞铁死亡过程具有铁依赖性，铁死亡期间亚铁离子(Fe2+)水平会明显增加[6]。高水平Fe2+会触发芬顿反应，显著提高脂质活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平，进而与细胞内不饱和脂肪酸反应产生脂质过氧化物(LPO)，诱发细胞死亡[7]。为促进芬顿反应，研究人员利用高性能纳米递药系统或铁基催化剂将外源性Fe2+递送至肿瘤组织内，最大程度地提高细胞内ROS水平[8-9]。随着铁死亡研究的不断深入，大量非铁基纳米制剂，如过渡金属氧化物、金属有机框架(MOF)、贵金属以及碳基催化剂等，也被证实具有类芬顿反应催化性能，可用于提高细胞内ROS水平[10-13]。此外，芬顿反应产生ROS的能力还受限于肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)中H2O2的浓度[14]。高性能纳米制剂能够在肿瘤病灶区驱动级联催化产生H2O2[15]，或是新型纳米制剂将H2O2直接递送至肿瘤组织内[16]，从而确保高效芬顿反应的发生。

1.2 纳米制剂下调肿瘤细胞中GPX4表达

谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4，GPX4)是多种铁死亡诱导剂的重要靶点，被认为是铁死亡的关键调控因子[17]。GPX4作为细胞内硒蛋白抗氧化酶表达受到严格调控，能够有效清除强还原性ROS，进而抑制铁死亡[18]。在特定的生物学背景下，可通过多种GPX4信号通路调控肿瘤细胞的铁死亡敏感性[19]。目前，报道最多的是通过谷胱甘肽(Glutathione，GSH)耗竭并下调GPX4表达，诱发铁死亡过程。研究表明，纳米催化剂通过氧化还原反应将还原型GSH氧化为L-氧化型谷胱甘肽(L-Glutathione Oxidized，GSSG)，持续的氧化应激导致GSH耗竭，使得GPX4中硒代半胱氨酸活性位点的GSH依赖性还原受损，从而导致GPX4通过β切割过程形成无氧还活性的脱氢丙氨酸和GPX4不可逆的功能失活[20]。此外，贵金属催化剂如Au纳米团簇通过形成强的Au-Fe键的方式来降低肿瘤组织内的GSH水平，导致GPX4活性下降，触发铁死亡[12]。最新研究发现，细胞铁死亡与二维纳米片的表面空穴密度呈高度正相关性。这是因为纳米片进入细胞溶酶体引发溶酶体膜损伤与Fe2+泄露，导致GPX4活性降低和LPO升高，从而加快细胞铁死亡的发生[10]。

1.3 铁死亡的其他作用机制

LPO增多是铁死亡发生的主要特征。细胞膜脂质的多不饱和脂肪酸能够经过一系列反应形成ROS，促进铁死亡[7]。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3能够激活多不饱和脂肪酸，并影响多不饱和脂肪酸的跨膜特性，诱发铁死亡[7，21]。研究表明，降低酰基辅酶A合成酶长链家族成员4和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3的表达，可降低LPO在细胞中的积累，抑制铁死亡[22]。此外，作为另外一种重要的铁死亡抑制因子，铁死亡抑制蛋白(FSP1)是非谷胱甘肽依赖的铁死亡抑制蛋白，对GPX4缺失引起的铁死亡有保护作用，可通过还原CoQ10来阻止脂质氧化，从而抑制实体肿瘤的铁死亡[23-24]。

2 基于铁死亡的协同纳米疗法

2.1 铁死亡协同化学动力学疗法

化学动力学疗法(Chemodynamic therapy，CDT)是一类催化内源性H2O2发生芬顿反应(或类芬顿反应)，产生强氧化性羟基自由基(·OH)用于肿瘤特异性治疗的新技术[25]。由于TME中H2O2和铁离子代谢水平不足，严重限制了CDT的治疗效果。为此，Liu等[26]构建了DMON@Fe0/AT多功能纳米平台，该多功能纳米平台响应肿瘤弱酸微环境，释放Fe3+和氨基三唑，氨基三唑可抑制过氧化氢酶活性，进而提高肿瘤内Fe3+和H2O2浓度。同时，该多功能纳米中的DMON组分通过耗竭GSH诱发肿瘤细胞内铁转运蛋白表达下调，干扰铁代谢从而促使肿瘤细胞内铁富集。体外实验及体内实验均证实DMON@Fe0/AT不仅发挥了高效的抗肿瘤作用，而且具有低毒性，为CDT协同的铁死亡模式提供了一种新型的纳米治疗策略。Yang等[27]通过在超薄MgFe层状双氢氧化物纳米片上负载PEG包封青蒿素(Art)构建了一种新型纳米杂化物A@P/uLDHs。A@P/uLDHs不仅能够原位激活Art，并且可自循环在肿瘤细胞内产生以C为中心的自由基，同时伴随GSH耗竭，引发铁死亡。在体外实验中，A@P/uLDHs培养的宫颈癌HeLa细胞显示出较低的细胞内GSH水平，并且明显抑制肿瘤细胞增殖。在体内抗肿瘤方面，使用A@P/uLDHs治疗的小鼠的平均相对肿瘤体积比使用Art治疗的小鼠小20倍并且生存期显著延长至54天。体外和体内实验结果均表明A@P/uLDHs是一种高效的纳米剂，可用于铁死亡增强CDT治疗。此类研究策略从功能性铁离子生物学代谢的独特角度出发，实现了铁死亡与CDT的有机协同，显著增强了抗肿瘤效果。

为了实现药物对肿瘤的特异性靶向递送，并延长化疗药物的血液循环时间，迫切需要构建简单和具有生物相容性成分的一体化纳米平台以促进多模式肿瘤治疗。史向阳团队利用具有优异生物安全性和生物相容性的天然植物多酚单宁酸(TA)与Fe3+之间的配位作用原位形成负载阿霉素的TAF纳米复合物，通过氢键作用力将纤连蛋白(FN)包覆于复合物，构建了DOX-TAF@FN纳米平台[28]。DOX-TAF@FN在酸性TME中比在正常组织中表现出更好的MR成像性能和显著的抗肿瘤疗效。这是因为TAF在弱酸性TME中解离后，TA将Fe3+转化为Fe2+，触发肿瘤内的芬顿反应，生成·OH，并进一步消耗GSH，诱导肿瘤细胞发生铁死亡，最终利用FN的修饰促进药物的靶向递送，通过CDT联合化疗实现增强铁死亡介导的免疫原性细胞死亡(ICD)，为构建简单和具有生物相容性的一体化纳米平台奠定了基础。

目前，基于铁死亡协同CDT抗肿瘤研究已取得较大进展。然而，协同策略治疗的作用机制尚不明晰。同时，实现此类药物的临床转化仍需对其长期疗效和体内降解性等因素进行有效评估。

2.2 铁死亡协同光动力疗法

铁死亡联合光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)已被广泛研究应用于癌症治疗[29-30]。PDT是一种新型非侵入性临床肿瘤治疗方法，其工作原理是对聚集在肿瘤组织区域的光敏剂进行照射，当光敏剂受光激发后将电子转移给周围O2分子，产生毒性单线态氧(1O2)杀死肿瘤细胞[31]。PDT基于光和ROS精准定位，具有高效、非侵入性、高度时空可控性和低耐药性等优点[32-34]，在抗肿瘤治疗方面展现出巨大的前景。然而，由于PDT的光穿透组织的能力有限，且耗氧量高，限制了其对TME缺氧区域中深部转移灶的治疗作用。为此，Chen等[29]设计了一种多功能的聚纳米系统Fe3O4-PLGA-Ce6，该纳米系统能够在弱酸性TME中解离并释放Fe2+/Fe3+和Ce6。释放的Fe2+/Fe3+诱发肿瘤细胞铁死亡，并与TME中过量的H2O2发生类芬顿反应产生·OH；释放的Ce6在激光照射下产生大量1O2，从而实现铁死亡-PDT协同抗肿瘤效果。在体内实验中，大量Fe3O4-PLGA-Ce6纳米制剂在肿瘤部位积聚，表明Fe3O4-PLGA-Ce6纳米制剂具有很好的肿瘤靶向性和滞留性，并且肿瘤抑制率高达92.4%。因此，Fe3O4-PLGA-Ce6纳米制剂具有铁死亡和PDT的协同治疗作用，可能是未来临床转化的一种有前途的纳米辅助药物。

高效纳米制剂的可控制备在近十年来得到迅速发展，但其仍面临药物负载能力低、生物毒性与代谢、临床转化难等多种问题[35-36]。与其他纳米颗粒载体不同，外泌体作为递送载体，含有跨膜蛋白，可增强内吞作用，在肿瘤治疗中表现出强的生物相容性、低免疫原性和强渗透性和滞留效应等优点，有望成为临床应用的载体[37]。Du等[38]构建的载药外泌体(Er/RB@ExosCD47)可借助CD47表面功能化而逃避单核吞噬细胞系统的吞噬，增加其在肿瘤组织内的分布，并释放Erastin，最终诱导肿瘤细胞发生铁死亡；此外，光敏剂在532 nm激光照射下，可诱导PDT产生ROS。在体内实验中，Er/RB@ExosCD47具有更低的全身毒性，更高的铁死亡-PDT的联合治疗效率，能有效地诱导荷瘤小鼠的肿瘤体积在100 mm3左右，显著延缓了肿瘤的生长，为实现高效靶向的铁死亡-PDT联合治疗恶性肿瘤提供了新思路。

2.3 铁死亡协同光热疗法

光热疗法(Photothermal therapy，PTT)由于其侵袭性小、毒性低和操作方便等固有优势，是一种有前景的抗肿瘤新策略[39]。PTT与PDT类似，也是一种借助外源光源新型肿瘤治疗策略，即光热剂在特定波长的光照射下，通过升高肿瘤区域的温度来实现肿瘤细胞的消杀[40]。尽管PTT可利用热量达到杀灭肿瘤细胞的效果，但在PTT过程中，会诱导肿瘤细胞大量表达热休克蛋白(HSP)增强肿瘤细胞的修复功能，并且提高肿瘤细胞对热应激的耐受程度[41]。有研究表明，在铁死亡过程中细胞内产生的ROS和LPO的上调可抑制HSP表达[42]，进而阻断肿瘤细胞对热应激的自我保护作用。此外，根据阿伦尼乌斯(Arrhenius)方程，当环境温度从20℃升至50℃时，芬顿反应速率增加约四倍[30，43]。因此，铁死亡-PTT联合疗法将是一种高效和安全的抗肿瘤治疗新策略。Zeng等[44]将克酮酸分子作为铁螯合剂和光热转换试剂，利用牛血清白蛋白对其进行包裹，构建了一种基于克酮酸的具有高生物相容性的纳米颗粒(Cro-Fe@BSA)。在肿瘤环境中，Cro-Fe@BSA具有可激活的光热效应。在不受激光照射的情况下，Cro-Fe@BSA纳米粒子使4T1细胞活力为(55.0±4.5)%，而在激光照射8 min后，细胞活力降为(13.5±2.3)%。同时，在激光照射下，Cro-Fe@BSA纳米粒子使肿瘤细胞Fe3+水平有一定程度的提高，这表明Cro-Fe@BSA纳米粒子在消耗细胞内GSH的同时能产生Fe3+。此外，Cro-Fe@BSA+激光处理4T1细胞的LPO和ROS上调，HSP70水平明显下调，而加入Fer-1后细胞HSP70表达恢复，这些结果表明上调的LPO和ROS可破坏细胞内的HSP，从而阻止细胞对PTT的自我保护机制。这是由于类芬顿反应的温度依赖性使光热效应能够促进自由基的形成，而热诱导形成的HSP会被铁死亡过程中产生的ROS破坏，从而解决肿瘤细胞对于热的自我保护机制，并且Cro-Fe@BSA纳米粒子也可以实现可激活的光声和磁共振成像，为设计新型高效的纳米诊疗药物实现多策略抗肿瘤提供了新策略。

2.4 铁死亡与多种疗法的联合

由于存在肿瘤异质性，铁死亡诱导策略联合其他单一疗法仍无法达到预期的治疗效果。目前，已有研究尝试通过构建多功能纳米平台将多种治疗方法与铁死亡相联合，实现多模式增强的肿瘤治疗效果[28，45-46]。例如Bai等[45]通过基因工程构建了表达转铁蛋白的细胞膜纳米囊泡，并将其用于包裹IR820-二氢青蒿素纳米药物(Tf@IR820-DHA)，Tf@IR820-DHA具有良好的肿瘤靶向性和负载Fe(Ⅲ)的能力，能够有效地将Fe(Ⅲ)和IR820-DHA纳米颗粒递送到病变部位。在体内抗肿瘤实验中，荷瘤的C57BL/6小鼠注射Tf@IR820-DHA纳米颗粒+超声治疗后相对于其他治疗组表现出更加显著的抗肿瘤效果，小鼠肿瘤几乎消失。这是因为该纳米颗粒通过激活的三重氧化应激放大(DHA诱导的CDT、GSH消耗诱导的铁死亡、IR820介导的声动力治疗)，能够实现高水平、肿瘤靶向性ICD，显著增加分泌IFN-γ的T细胞(CD4+T和CD8+T)的比例，从而增强a-PD-L1介导的免疫检查点阻断治疗。因此，这些多功能治疗组合，将多种治疗方式整合到一个纳米系统中，在肝癌小鼠模型中表现出优异的治疗效果，与单一疗法相比显示出明显的优势。此外，Xiong等[46]制备了一种由DOX、TA和光敏剂IR820组装而成的纳米激活剂(DAR)，实现了化疗、PDT、铁死亡及免疫治疗相联合的治疗效果，显著抑制了荷瘤小鼠的肿瘤生长，DAR治疗组小鼠的肿瘤经过治疗后几乎不再生长。

基于铁死亡发展的多策略协同抗肿瘤治疗效果比单一疗法表现出明显的优势。开发多功能智能化的治疗系统对发展基于铁死亡的多策略疗法具有十分重要的意义。然而，这些新型联合多策略疗法还存在一些缺陷和潜在风险，阻碍其进一步的临床应用。首先，这些纳米组合系统的复杂性难以实现工业化生产。其次，无法准确计算出多种疗法之间的协同效应。最后，多种药物或方法联合是否会导致药物毒性和副作用的叠加尚不明确。

3 小结与展望

新兴的生物医学技术与传统的治疗方法相结合已成为癌症治疗的趋势。铁死亡作为癌症治疗的一个新靶点，在肿瘤生物学和抗肿瘤治疗中受到广泛的关注。本综述阐述了该领域的最新趋势，着重强调了以铁死亡诱导剂为基础的纳米制剂的开发以及基于铁死亡的纳米技术和其他治疗方式相结合的联合应用。目前，以铁死亡为基础的恶性肿瘤治疗取得了诸多成果及研究进展，多种调控铁死亡的酶的存在使得靶向治疗的应用成为可能。然而，基于铁死亡的恶性肿瘤纳米疗法仍处于探索阶段，在临床实践中仍存在诸多问题亟待解决，首先，铁死亡诱导剂具有潜在毒副作用，如何在保证肿瘤特异性诱导铁死亡的前提下，同时避免对正常组织的脱靶毒性效应仍具有较高挑战性；其次，对于纳米制剂设计过程中产生的叠加毒性及工业可行性仍需进一步评估。因此，未来仍需更多研究来深入探索基于铁死亡纳米制剂的研发，需综合多方面因素，才能设计出安全有效的新型纳米制剂。