PI3K信号通路介导椎间盘髓核细胞凋亡的研究进展

黄继尚，周庆锣，姬广林

（1.赣南医学院2020级硕士研究生；2.赣南医学院第一附属医院骨科，江西 赣州 341000）

椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）是临床上颈腰背部疼痛和神经根性疼痛的主要原因之一。髓核细胞凋亡是影响椎间盘发生退变的重要因素之一［1］。髓核细胞凋亡作为一种由多信号途径调控的细胞程序性死亡过程，磷脂酰肌醇-3激 酶（phosphoinositide3kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶A（protein kinase A，Akt）信号途径在其中占有重要地位。但目前对椎间盘髓核细胞凋亡的机制尚不十分明确，本文主要就PI3K/Akt信号转导通路的结构特征、与髓核细胞的联系及其在IDD髓核细胞凋亡中的调节机制等方面的研究进展进行综述。

1 椎间盘退变与髓核细胞凋亡

椎间盘（intervertebral disc，IVD）由髓核、纤维环和软骨终板三部分组成，由于其内无血管又缺少细胞结构且直接与椎体骨组织相连，需要时刻缓冲椎体所传递而来的压力负荷，因此易于变性退化。IDD作为一种加重社会和个人经济负担的公共卫生问题，在全球的发病具有普遍性。中国正在进入老龄化社会，IDD的发病率逐年升高且发病具有年轻化趋势。调查显示［2］，在大于40岁的人群中患有IDD的占60%以上。大量临床前期研究表明，IDD的进展受衰老、高糖、营养缺乏和炎性因子等影响，在这些因素的干预下，退变椎间盘中的髓核细胞会出现蛋白多糖和胶原纤维分泌减少［3］、细胞死亡数量增加、与衰老相关β-半乳糖苷酶表达增加、细胞表型改变等现象［4-5］。髓核细胞数量减少的程度与髓核纤维化增加的频率具有一定相关性，这意味着髓核细胞凋亡所致的细胞数量减少参与了IVD退变过程。GRUBER H E等［6］使用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）分析鉴定凋亡，通过与健康对照的IVD相比，退变的IVD具有明显更多的TUNEL阳性细胞。因此可以认为髓核细胞凋亡是IDD重要的病理学特征，是参与椎间盘退行性改变的重要因素之一。

2 PI3K/Akt信号途径

2.1 PI3K的结构PI3K是一种胞内的磷脂酰肌醇激酶，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3类激酶，本文主要介绍研究最广泛的Ⅰ类激酶。Ⅰ型PI3K分为ⅠA和ⅠB两种亚型，分别由酪氨酸激酶受体和G蛋白受体传导信号。ⅠA型PI3K是由调节亚基p85和催化亚基p110所组成的异源二聚体［7］。其中调节亚基是受体酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase，RTK）的磷脂蛋白底物，含有SH2和SH3结构域，在正常状态下对PI3K发挥抑制作用。含有SH2结构域的蛋白质能够与其他蛋白质内的磷酸化酪氨酸残基对接，有助于受体酪氨酸激酶途径的信号转导。催化亚基有四种，包括P110α、P110β、P110γ、P110δ，除P110δ外其余均广泛分布在各种细胞中［8］。

2.2 PI3K的激活与信号的传递PI3K/Akt通路对调控细胞增殖、分化和凋亡具有重要意义。PI3K有两种不同的激活方式。细胞外信号如成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、人生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）、细胞因子、胰岛素等都可以启动PI3K的激活，当上述相应的配体与其受体结合可激活RTK并导致其自身酪氨酸残基发生磷酸化［9］。活化的RTK参与了PI3K不同的激活方式：其一，活化的RTK通过鸟苷酸释放因子促进二磷酸鸟苷（Guanosine diphosphate，GDP）释放，从而使Ras活化，之后Ras直接与P110结合激活PI3K；其二，RTK自身磷酸化的酪氨酸残基与PI3K调节亚基的SH2（src同源序列2）结构域相互作用，通过变构调节并激活PI3K的催化亚基P110。PI3K被激活后其P110亚基能磷酸化质膜上磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）的D3位点，使其产生磷脂酰肌醇4，5-三磷酸（PIP3）［8］，有部分PIP3会被5-磷酸化酶水解进而脱磷酸化为PIP2。PIP3和PIP2均可在胞外信号的刺激下为一些结合到质膜的蛋白激酶提供必要的结合位点，并作为细胞内的第二信使将信号传递至下游的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt），随后Akt的Ser473和Thr308位点发生磷酸化进而产生反应活性。激活后的Akt主要通过调节下游的底物蛋白而发挥其各自特定的生物学功能。

3 PI3K与髓核细胞的增殖

PI3K通路与细胞增殖有密切联系，其正常表达也对髓核细胞的增殖、分化有不可或缺的作用。研究发现，PI3K/Akt通路促进细胞增殖的作用是通过推动细胞周期的进展实现的。P21、Waf1等蛋白可以使细胞处于细胞周期的静止状态，P27、Kip2等可以维持细胞处于G1期。Akt通过磷酸化上述蛋白使其滞留在细胞质内而抑制其抗增殖作用。Akt还能够调节细胞周期蛋白CDK2/4进入S期诱导DNA合成，促进细胞增殖。除此以外，Akt还可以磷酸化糖原合成酶激酶-3（GSK-3），上调β-catenin的表达从而阻止cyclinp的降解发挥促进细胞增殖的作用［10］。许多体内外研究表明，持续激活PI3K的P110亚基可以增加Ⅱ型胶原、蛋白聚糖的分泌和促进髓核细胞的增殖［11-12］。张晓军等［13］以人髓核细胞为研究对象，将髓核细胞随机分为3组。实验组给予低强度脉冲超声刺激，对照组同条件培养不给予超声刺激，LY294002组给予超声刺激并加入PI3K的抑制剂LY294002共培养。1周后发现实验组髓核细胞的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的mRNA、蛋白质以及磷酸化的Akt表达水平较对照组增高；而LY294002组髓核细胞胞外基质的合成发生下降现象。该实验表明了脉冲超声促进髓核细胞的增殖是通过激活PI3K信号途径完成的。反之，如果在正常增殖的髓核细胞中抑制PI3K的传导通路，那么髓核细胞会出现增殖减缓的现象［10］。ZHAN D等［14］通过构建PTEN过表达和抑制质粒，发现髓核细胞因PI3K的抑制剂PTEN表达增加而出现显著的增殖减弱。

4 PI3K与髓核细胞凋亡

4.1 PI3K在髓核细胞中的抗凋亡机制大量研究表明，PI3K信号通路在椎间盘髓核细胞凋亡的过程中发挥重要作用［11-12］。在正常的髓核细胞中，PI3K可通过对磷脂酰肌醇位点上的磷酸基团进行定点转移，使其产生抗细胞凋亡的生物信号。借助其自身第二信使的功能将信号传递到通路下游靶点蛋白激酶并发挥作用。PI3K信号通路可通过对抗各种不良因素如衰老、高糖环境等诱导的髓核细胞凋亡而延缓IDD的进展，同时该通路受损也会加速IDD的进展。

人体内磷脂酰肌醇的肌醇环上共有5个可被磷酸化的位点，多数激酶均可磷酸化肌醇环的第4、5位点。在一般情况下，PIP2在磷脂酶C的作用下产生二酰甘油（Diacylglycerol，DAG）和磷脂酰肌醇-1，4，5-三磷酸。但在PI3K信号通路的调控下，激活后的PI3K可发挥磷酸化底物的作用转移一个磷酸基团到磷脂酰肌醇上的第3位点，这是PI3K通路对细胞增殖和凋亡产生重要影响的分子基础［15］。如单磷酸化的PI-3-磷酸可以刺激细胞迁移，PI-3，4-二磷酸具有促进细胞增殖、增强细胞抗凋亡能力的特性，这些功能是其前体分子所不具备的。PI3K/Akt信号通路作为软骨细胞凋亡中的重要抑制通路，当PI3K被细胞外信号刺激时，激活的PI3K可以磷酸化PIP2使其产生PIP3。PIP3和PIP2作为一种锚定物，均可在胞外信号的刺激下为一些结合到质膜的蛋白激酶提供必要的结合位点，许多有PH结构域的蛋白比如AKT和PDK，均可以与PIP2、PIP3选择性结合，这种结合通过控制蛋白与细胞膜结合的时间和定位调节蛋白的活性。

Akt也叫蛋白激酶B，包含3种功能各异的亚型（Akt1、Akt2、Akt3），是PI3K信号转导途径中一个重要的下游靶蛋白。Akt接受上游PI3K传递来的信号后，其PH（pleckstrin homology）结构域可在磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶协助下与PIP3和PIP2结合并从胞质转位到质膜，从而改变自身结构以促进Ser473和Thr308位点磷酸化，这是Akt产生活性的重要前提。激活后的Akt可通过多种方式调控髓核细胞的凋亡［16］。主要分为两大类：①通过抑制磷酸化B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子（Bad）使其失活、抑制caspase-9的磷酸化、抑制GSK-3的活性、抑制线粒体释放凋亡诱导因子（apoptosis induce factor，AIF）等凋亡相关因子而直接抑制髓核细胞的凋亡；②通过抑制NF-κB、Yap等凋亡因子，促进环磷腺苷效应元件结合蛋白（Cyclic AMP-response element-bind-ing protein，CREB）、鼠双微粒体2（Murine double minute 2，Mdm2）等转录因子的活性而间接调控髓核细胞的凋亡。

4.2 Akt直接调控的下游效应分子

4.2.1 BadBad是与B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）结合并抑制其抗凋亡潜能的Bcl-2蛋白家族成员。但当Bad在Ser136上被Akt直接磷酸化时，Bad会从线粒体膜上的Bcl-2复合体中脱离，并与胞质蛋白形成复合物，从而使其促凋亡功能失活。磷酸化后的Bad与抗凋亡因子Bcl-2解聚后还导致游离的Bcl-2活性增加，因此Bad被认为是Akt抗细胞凋亡的直接靶点之一［17］。

4.2.2 糖原合酶激酶-3（GSK-3）GSK-3作为一种丝氨酸蛋白激酶是Akt的一个重要的靶点，GSK-3包括两种亚型：GSK-3α和GSK-3β。GSK-3β在如DNA损伤、缺氧、内质网应激等情况下会诱发凋亡。GSK-3β还可以通过抑制存活因子CREB和调控促凋亡因子p53来诱导细胞凋亡。Akt可介导GSK-3氨基端丝氨酸（GSK-3α的Ser21和GSK-3β的Ser9）的磷酸化来减弱其生物活性，从而达到抑制细胞凋亡的目的［18］。BAI X等［19］借助了人髓核细胞培养体系和IL-1β诱导细胞凋亡的模型证实了白藜芦醇和17β-雌二醇联合通过Akt磷酸化GSK-3β减弱其活性从而达到抑制髓核细胞凋亡的作用。

4.2.3 Caspase-9含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）是一组存在于细胞质中的蛋白酶，它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能特异性地切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键从而造成细胞凋亡。Caspase-9作为细胞凋亡的起始和效应因子，其接收凋亡蛋白诱导因子的信号形成凋亡复合体，激活下游的caspase3/7，从而诱导细胞凋亡。激活的Akt可磷酸化caspase-9的Ser196位点［20］，导致其活性减弱从而使caspase家族诱导凋亡级联反应受抑制，最终发挥抗细胞凋亡作用。MING-YAN Y等［21］开展对高糖环境下的人髓核细胞的培养研究发现，胰高血糖素样肽1（GLP-1）是通过介导PI3K/Akt/caspase-3通路激活Akt对caspase蛋白酶的磷酸化抑制进而表达出抗髓核细胞凋亡的功能。然而，caspase-9的磷酸化位点在小鼠或大鼠中并不保守［22］，这表明Akt对caspase-9的调节可能不是主要的调节途径，或者该位点的磷酸化是高等生物所特有的。

4.2.4 AIFAIF是位于线粒体膜上的一种氧化还原酶，具有很强的促凋亡活性［23］，内部含有线粒体定位信号和核定位信号序列。当细胞受到凋亡信号的刺激后，线粒体膜上的通透性转换孔开放，AIF被释放到细胞质中，具有核定位序列的AIF便可进入到细胞核内，引起染色质凝集和DNA片段化从而引发不依赖caspase的细胞凋亡途径。激活的Akt可以抑制线粒体膜转换孔的开放，从而阻滞AIF的释放和核内转运，最终发挥抗凋亡的作用［24］。

4.3 Akt间接调控的下游效应分子

4.3.1 核转录因子κB（NF-κB）核转录因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是一类能识别多种基因启动子κB位点并与其发生特异性结合促进转录DNA蛋白的总称。NF-κB是由两种Rel家族亚基RelA、RelB和NF-κcB1、NF-κcB2中任意两种亚单位构成的二聚体蛋白质。一般情况下，NF-κB与IκB（inhibitor of NF-κB）构成三聚体，IκB结合于NF-κB的核定位信号区，使之以无活性状态存在于胞质中。在大多数情况下，NF-κB的激活依赖于IκB激酶（IκB Kinase，IKK）复合物的磷酸化和NF-κB抑制剂IκB的降解［25］。当细胞受外界活化信号刺激时，IκB激酶可被激活，诱导磷酸化后的IκB继续发生泛素化进而被蛋白酶水解，已被证明的是Akt可激活IκB激酶，导致NF-κB的抑制剂IκB发生降解，从而使NF-κB释放并快速进行核转位，接着激活拮抗细胞凋亡的基因表达而有利于细胞的存活。HE S H等［26］将髓核细胞分为实验组和对照组，实验组用姜黄素预处理，对照组不做任何额外的干预措施，将所有髓核细胞暴露在肿瘤坏死因子α（TNF-α）下。实验结果表明，经过姜黄素处理的髓核细胞其炎性因子表达下降，PI3K/Akt/NF-κB相关信号分子的mRNA和蛋白质水平表达增加，且髓核细胞凋亡减少。HE S H等［26］通过尾椎C6/7水平穿刺建立小鼠IDD模型，术后给予部分小鼠姜黄素治疗，结果显示，经过姜黄素治疗的小鼠IDD严重程度较对照组低，这证明姜黄素是通过Akt/NF-κB途径抑制髓核细胞的凋亡和延缓IDD的进展。

4.3.2 Mdm2鼠双微粒体2（Murine double minute 2，Mdm2）作为由p53诱导的癌基因产物，是一种泛素蛋白连接酶。p53是应激反应中细胞死亡的主要调节因子。Mdm2是p53重要的负调控因子之一，且Mdm2也受到p53的转录调节，Mdm2的蛋白表达水平增加会导致p53功能失活。研究发现，Akt可与两个残基Ser166和Ser186结合并磷酸化Mdm2，导致其核导入或泛素连接酶活性上调［27］。因此，活化的Akt可通过Mdm2而诱导p53失活或降解，并破坏p53介导的促凋亡转录反应。JIN L Z等［27］通过体内实验发现，沉默SUMO2基因可以增加p53通路Mdm2的表达而发挥对大鼠椎间盘退变髓核细胞凋亡的保护作用。

4.3.3 CREB环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）是由Yamamoto在PCI2细胞系的核提取物与大鼠脑组织中分离得到的可与环腺苷酸反应元件（CRE）选择性结合的核蛋白。CREB被称为调节转录的核因子，CREB和CRE结合后可提高CRE下游增殖基因的转录活性［28］。Akt可磷酸化CREB的Ser133位点，这一过程可引发CREB的转录激活以及CREB与CRB的亲和力增加。CREB与CRE结合形成的CREB-CRE复合物会进入细胞核内与环磷酸腺苷（cAMP）反应元件继续结合，进而促进细胞相关生长基因的表达。CREB还被证明通过介导Akt通路上调一些抗凋亡基因的表达，如bcl-2、mcl-1［29］。CREB影响髓核细胞凋亡具体的效应机制还需进一步研究。

4.3.4 YAPYes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）作为一种Akt底物，由14-3-3结合蛋白纯化而成，具有较强的促细胞凋亡能力。WEI L等［30］发现软骨素合成酶3的消耗可以通过髓核细胞肌动蛋白张力介导YAP的激活，进一步诱导小鼠自发性IDD。Akt能够以PI3K激酶依赖的方式磷酸化Ser127上的YAP。磷酸化的YAP通过核内YAP与p73的转录活性反馈调节而介导凋亡抑制因子，发挥抗凋亡作用［31］，但YAP与PI3K通路对椎间盘髓核影响的相关基础研究还有很大的研究空间。

5 小结与展望

髓核细胞数量的减少在IDD的发生发展中扮演着重要角色。髓核细胞的增殖障碍、凋亡和细胞外基质的降解均能引起髓核细胞的数量减少，从而引发IDD。维持髓核细胞的正常功能有赖于其细胞外基质如蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成与分解平衡，这种平衡依赖于不同代谢通路的信号分子对髓核细胞微环境的调节。在IDD中，髓核细胞的分解代谢强于合成代谢，导致细胞外基质的降解和髓核细胞凋亡均增加。PI3K/Akt通路与髓核细胞增殖和凋亡密切相关，其主要通过调控髓核细胞的凋亡影响IDD的发病。PI3K/Akt信号通路对髓核细胞具有保护作用，可降低高糖、机械负荷、炎症反应等危险因素对髓核细胞产生的不良影响，并在改善IDD上发挥一定作用。随着人口老龄化的增加，PI3K/Akt通路有望成为各种危险因素诱导的IDD潜在的治疗靶点，进一步探究PI3K/Akt通路有助于阐明IDD发病的分子机制，进而发现通路下游中一些靶蛋白的未知作用，研究上游通路不同的激活方式和信号传导途径，寻找提高PI3K/Akt通路活性的特异性药物，这可以为IDD的防治提供线索，对未来改善老年患者的生活质量具有重大的临床意义。