加味独活寄生合剂缓解小鼠膝骨关节炎过程中肠道菌群的参与机制

易南星，米倚林，许晓彤，李纳平，严 可，邝高艳，卢 敏

(1. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2. 湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨退变、骨赘形成和滑膜炎症为主要病理表现的致残性疾病，临床表现主要为疼痛、功能障碍和关节畸形[1]。OA给患者及社会造成了巨大的经济负担，随着全球人口老龄化和肥胖人数日益增加，OA正变得越来越普遍[2]。然而，OA的发病机制尚不十分清楚，也缺乏有效的治疗药物。

肠道菌群作为肠道微生态的重要组成部分，直接或间接地参与人体的免疫调节、能量供应、消化吸收、脂肪代谢等多种生理病理过程[3]。生理情况下，肠道菌群与机体及外界环境间保持相对平衡的状态，以维持机体稳态，而这种平衡一旦被打破，便可能引起肠道菌群失调乃至疾病[4]。在OA研究中，基于“肠道-关节”轴理论，越来越多的研究探索肠道微生态在OA病程中的作用，研究表明，肠道菌群可能参与关节软骨破坏和骨关节炎引起的疼痛[5]。

加味独活寄生合剂是湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，由多名老中医经验方经过严格的制备工艺制成，其临床疗效优良，课题组前期采用超高效液质联用分析加味独活寄生合剂及含药血清中有效成分[6]，并从多方面证实其疗效机制。中医药治疗疾病具有多成分、多靶点、多通路的特点。已有报道加味独活寄生合剂对于膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)有治疗作用[7-8]，但此过程中是否有肠道菌群的参与还未见报道。故本研究拟采用16S rRNA测序技术研究加味独活寄生合剂对KOA模型小鼠肠道菌群的影响，以期从“肠道-关节”轴角度阐释加味独活寄生合剂治疗KOA的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 动物8周龄 ♂ C57BL/6小鼠18只，SPF级，饲养于温度(20～26)℃、相对湿度40%～70%，每小时通风换气15次，光照12 h/12 h明暗交替环境。由湖南中医药大学动物实验中心订购，合格证号SCXK(湘)2019-0004，所有动物实验均符合湖南中医药大学实验动物伦理委员会的规定。

1.2 药物加味独活寄生合剂由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供，组成：独活6 g，桑寄生18 g，杜仲12 g，牛膝6 g，细辛3 g，秦艽6 g，茯苓12 g，肉桂3 g，防风6 g，川芎6 g，党参12 g，甘草3 g，当归12 g，白芍10 g，熟地黄15 g，制天南星6 g，黄芩6 g，木瓜12 g，威灵仙12 g。制备流程：将以上19味药加水浸泡0.5 h，煎煮2次，第1次加10倍量水煎煮2 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，煎液滤过、合并，浓缩成250 mL后分装备用。

1.3 试剂与仪器脱毛膏(利洁时)，异氟烷(瑞沃德)，多聚甲醛、乙二胺四乙酸、无水乙醇、氨水、二甲苯(国药)，番红O染液，固绿染液，石蜡，中性树胶(Sigma)，苏木精(Wellbio)，DAB试剂盒(中杉金桥)，Ⅱ型胶原抗体(Proteintech)。小动物麻醉机(Matrx VMR 美国)，组织脱水机(Leica，TP1020)，组织包埋机(Leica，EG1150C)，组织切片机(Leica，RM2235)，组织展片机(Leica，HI1210)，组织烤片机(Leica，HI1220)，全片扫描仪(Olympus)。

1.4 KOA模型制备、分组及给药小鼠适应性饲养1周，按随机数法将小鼠分为假手术组、KOA模型组、KOA模型+加味独活寄生合剂组(简称给药组，下同)，6只/组。按文献方法采用内侧半月板失稳(destabilization of medial meniscus，DMM)手术诱导建立KOA模型[9]，简述如下：右膝关节内侧髌韧带与内侧副韧带之间开0.5 cm切口，显微镜下暴露、剪断内侧半月板胫骨韧带，缝合切口。假手术组：在相同部位开0.5 cm切口，缝合切口，碘伏消毒，放回笼内，等待小鼠苏醒。给药组：加味独活寄生合剂参考人体剂量(125 mL·d-1)，并按人(70 kg)和小鼠(20 g)体表面积折算等效剂量，小鼠剂量为16.25 mL·kg-1，于术后1周灌胃给药。另外两组灌予生理盐水，每天1次，持续至第8周。

1.5 关节软骨番红O-固绿染色膝关节取材后，4%多聚甲醛固定48 h，10%EDTA脱钙液脱钙14 d，每3 d更换脱钙液1次，脱钙完成后流水冲洗标本2 h，自动脱水机进行脱水透明处理，石蜡包埋，4 μm切片，烤片3 h后进行番红O-固绿染色，中性树胶封片后显微镜采集图像，观察关节软骨变化情况。

1.6 关节软骨Ⅱ型胶原免疫组化染色60 ℃烤片3 h，二甲苯、梯度乙醇中脱蜡、脱水、透明，蒸馏水浸洗5 min；37 ℃恒温箱中酶修复抗原30 min，PBS洗3次；Ⅱ型胶原抗体孵育(1:1 000)，4 ℃冰箱中过夜，复温30 min，PBS浸洗3次；二抗常温孵育30 min，PBS浸洗3次；DAB显色，室温孵育约3 min，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；苏木精复染5 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片、显微镜观察摄片。

1.7 肠道内容物高通量测序收集小鼠结肠样本，-80 ℃保存。DNA提取试剂盒提取粪便样本总DNA，dsDNA HS Assay Kit for Qubit试剂盒测定DNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。采用引物341F和805R通过PCR扩增V3-V4区域，纯化与定量后，构建测序文库。采用Qiime 2分析流程，调用DADA2对Raw Data进行去噪，以100%的相似度聚类，对低质量序列进行去除和校正、算法识别去嵌合等，去噪序列直接去冗余，获得扩增子序列变异(amplicon sequence variants，ASV)信息。将ASV的代表序列与 Silva-132-99数据库中的模板序列进行比对，得到所有ASV在微生物门、纲、目、科、属、种分类水平下的菌群信息。通过分类学组成分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析、LefSe分析和MetaCyc代谢途径预测等方法对肠道菌群进行分析。

2 结果

2.1 加味独活寄生合剂对关节软骨的影响番红O-固绿染色结果发现，假手术组小鼠关节软骨、半月板形态正常，软骨面光滑完整，软骨厚度正常，无明显病理表现。与假手术组比较，模型组均出现软骨面不完整，软骨厚度丢失，半月板缺损等明显病理表现，胫骨侧关节软骨面积与国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)评分差异均有显著性(P<0.01)，说明KOA模型成功建立。与模型组比较，给药组软骨面更加完整，软骨厚度增加，细胞外基质丢失减少，胫骨侧软骨面积统计发现，两组间差异具有显著性；OARSI评分发现，模型组评分比假手术组明显升高，加味独活寄生合剂治疗后OARSI分值明显降低，番红O-固绿染色结果表明，加味独活寄生合剂能够减轻关节软骨损伤，延缓了KOA的进展(见Fig 1)。

Fig 1 Effect of Jiawei Duhuo Jisheng Mixture on articular cartilage

2.2 加味独活寄生合剂对关节软骨Ⅱ型胶原的影响Ⅱ型胶原是关节软骨细胞外基质中最主要的组成成分，能反映关节软骨的退变程度。膝关节关节软骨Ⅱ型胶原免疫组化染色结果发现，假手术组小鼠关节软骨中Ⅱ型胶原阳性染色明显，分布均匀，表明Ⅱ型胶原含量丰富，细胞外基质无明显降解。与假手术组比较，模型组关节软骨Ⅱ型胶原阳性染色明显变浅，且分布不均匀。与模型组比较，加味独活寄生合剂组关节软骨中Ⅱ型胶原阳性染色增加，分布较均匀。实验结果表明，加味独活寄生合剂能够增加关节软骨中Ⅱ型胶原的含量，减轻细胞外基质降解，延缓关节软骨退变，见Fig 2。

Fig 2 Effect of Jiawei Duhuo Jisheng Mixture on collagen Ⅱ

2.3 加味独活寄生合剂对肠道菌群丰度的影响实验结果显示：各组之间肠道菌群在门、纲、目、科、属、种水平上均体现出差异。在门水平上，厚壁菌门相对丰度在各组依次表现为，假手术组(72.7%)，模型组(30.1%)，给药组(32.3%)；变形菌门相对丰度为假手术组(12.9%)，模型组(13.9%)，给药组(38.3%)；拟杆菌门相对丰度为假手术组(9.0%)，模型组(38.4%)，给药组(22.6%)。在目水平上，拟杆菌目相对丰度为假手术组(8.9%)，模型组(38.2%)，给药组(22.2%)。在属水平上，乳杆菌属相对丰度在各组依次表现为，假手术组(64.1%)，模型组(16.3%)，给药组(6.9%)；阿克曼菌属表现为假手术组(3.1%)，模型组(9.9%)，给药组(0.6%)，见Fig 3。

Fig 3 Effect of Jiawei Duhuo Jisheng Mixture on abundance of intestinal

2.4 加味独活寄生合剂对肠道菌群Alpha多样性的影响Alpha多样性用于分析样本内的微生物群落多样性，单样本的多样性分析可以反映微生物群落的丰富度和多样性，Observed表示实际观察到的ASV种类数；用Chao1和ACE指数反映样本的丰富度，Shannon和Simpson指数反映多样性。结果显示：与假手术组比较，模型组与给药组Chao1指数均具有明显差异，表明KOA模型小鼠肠道菌群生物多样性发生明显变化。与模型组比较，给药组Chao1、Observed、Simpson指数有差异趋势，表明加味独活寄生合剂能够影响KOA模型小鼠肠道菌群丰富度和多样性，见Fig 4。

Fig 4 Effects of Jiawei Duhuo Jisheng Mixture on alpha diversity of intestinal flora

2.5 加味独活寄生合剂对肠道菌群Beta多样性的影响Beta多样性分析以样品间距离反映物种差异程度，主坐标分析(Principal Co-ordinates Analysis，PCoA)和非度量多维尺度法(Non-metric multidimen-sional scaling，NMDS)是两种研究数据Beta多样性的可视化方法。本实验结果表明，3组之间两两比较差异均大于组内的差异(R=0.704)，3组之间肠道菌群结构差异具有显著性。PCoA分析显示，组内距离较近，表示差异性较小，组间距离远，差异性大，PCoA1能够反映出各组间64.8%的差异性，PCoA2为23.4%；NMDS分析体现出与PCoA一致的实验结果，见Fig 5。

Fig 5 Effects of Jiawei Duhuo Jisheng Mixture on beta diversity of intestinal flora

2.6 标志菌群LefSe分析采用线性判别分析(linear discriminant analysis effect size，LefSe)在不同组间具有统计学差异的标志菌群(P<0.05)。LefSe分析结果显示，3组均存在丰度差异明显的物种。假手术组中，乳杆菌目(Lactobacillales)、乳酸菌属(Lactobacillus)、厚壁菌门(Firmicutes)、Anaerostipes等物种丰度差异明显；模型组中，δ变形菌纲(Deltaproteobacteria)，脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、梭杆菌门(Fusobacteria)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus-reuteri)、放线菌科(Actinomycetaceae)等物种丰度差异显著；给药组中，变形菌门(Proteobacteria)，韦荣球菌属(Veillonella)，奈瑟菌科(Neisseriaceae)，假单胞菌目(Pseudomonadales)等物种丰度差异显著。从Fig 6中可以看出，模型组和给药组差异菌群数量均增加，给药组增加更明显，而这些差异菌是否在KOA发生发展中发挥作用，或是加味独活寄生合剂发挥疗效的潜在菌群，还有待深入研究。

Fig 6 LefSe analysis of marker flora

2.7 肠道菌群MetaCyc分析为了确定肠道微生物区系的分类变化是否影响其功能，本研究通过Picrust2对代表性序列进行功能预测，MetaCyc(https://metacyc.org/)是通过实验手段阐释代谢通路的数据库。本实验MetaCyc结果显示，与模型组比较，给药组在脂肪酸β-氧化I(fatty acid β-oxidation I)、己糖醇发酵乳酸、甲酸、乙醇(hexitol fermentation to lactate，formate，ethanol and acetate)、L-色氨酸生物合成超通路(superpathway of L-tryptophan biosynthesis)、乙醛酸循环(glyoxylate cycle)、醇代谢和降解超通路(superpathway of glycol metabolism and degradation)等代谢通路增强，而paromamine生物合成Ⅱ(paromamine biosynthesis Ⅱ)和核糖霉素生物合成(ribostamycin biosynthesis)代谢通路减弱见Fig 7。

Fig 7 MetaCyc analysis of intestinal flora

3 讨论

加味独活寄生合剂，以治疗痹证经典方独活寄生汤为基础，加制天南星、黄芩、木瓜、威灵仙制备而成，临床广泛应用于KOA的治疗。课题组前期研究表明，加味独活寄生合剂可以抑制Wnt信号通路、调节Sox9、Ⅱ型胶原蛋白表达，促进软骨细胞增殖和分化[7]；此外，加味独活寄生合剂可以减少关节液中IL-1、IL-6和TNF-α含量，抑制炎症反应，减轻疼痛，改善患者关节功能和临床症状[8]。本实验表明，加味独活寄生合剂能够减轻关节软骨损伤，延缓KOA疾病进程。研究表明，肠道微环境稳态及其代谢物与OA的发生发展密切相关，肠道菌群通过调节远端器官的免疫功能或代谢物通过受损的肠上皮细胞直接进入血液循环系统，合成并释放炎症相关因子诱发炎症反应，促进OA关节继发性炎症的发展[10]。本实验还发现，加味独活寄生合剂能够调控KOA模型小鼠肠道菌群微生态、增加菌群丰度、改善菌群多样性、影响菌群代谢。因此，调控肠道菌群微环境可能是加味独活寄生合剂延缓KOA进程的潜在机制。

基于16S rRNA技术研究肠道菌群，多采用ASVs、Alpha与Beta多样性等指标进行分析与评价。ASVs划分以99%的序列相似度作为OTU划分阈值，在某一确定的分类水平进行序列双端合并，对不同来源的微生物群落样本进行互相比较[11]。Alpha多样性主要反映组内样本的测序深度，以此判断微生物多样性是否具有分类学意义。本文研究发现加味独活寄生合剂组能够增加KOA小鼠肠道菌群Alpha多样性的丰富度指数(Chao 1)和多样性指数(Simpson)，表明加味独活寄生合剂具有多成分、多靶点进行干预的特性，但具体是调节肠道中何种菌群的丰度和多样性从而起到治疗作用尚不清楚，有待下一步深入研究。Beta多样性分析考察不同组别之间群落结构的差异性为主，通过PCoA分析和NMDS分析对菌群结构进行自然分解，并通过对样本定位、分析、归类等方法观测样本之间的差异性。本实验发现，Beta多样性指数显示组内各样本间群落差异性良好(R=0.704)，表示实验重复性较好，具有可比性；组间差异有显著性且PCoA分析与NMDS分析一致。证明加味独活寄生合剂能够调控肠道菌群丰富度和多样性发挥干预KOA的作用。

运用分类学组成和聚类学分析发现，加味独活寄生合剂主要影响厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门，其所占比重之和超过总体菌群数量的95%。厚壁菌门在肠道中能够帮助多糖发酵，其芽孢杆菌属的主要作用是维持肠道微生态平衡[12]。研究表明，脆弱拟杆菌可降解肠黏膜屏障的重要组成成分-粘蛋白，粘蛋白降解可破坏肠黏膜屏障的完整性，另外，拟杆菌属升高往往和肠道菌群紊乱有关，当乳酸杆菌等有益菌减少时，肠道内竞争抑制作用削弱，条件致病菌生长占优势，拟杆菌属比例的增加，可上调细菌毒素，加重炎症因子释放[13]。本实验结果表明，加味独活寄生合剂能够增加KOA模型小鼠肠道中厚壁菌门的丰度，且明显降低拟杆菌门的丰度，改善厚壁菌门/拟杆菌门的比值，提示其治疗作用可能与增加肠屏障保护功能菌，降低肠源性内毒素释放，减轻炎症有关。阿克曼菌属是近年来热门研究菌属，约占疣微菌门的83%，占总肠道微生物的1%～4%，具有转化肠道上皮黏蛋白为碳源、氮源的生理功能，可减弱肠道黏液屏障厚度，阿克曼菌属能加剧鼠伤寒沙门菌诱发的肠道炎症，破坏宿主肠道黏膜的微生物平衡[14]。本实验中，模型组阿克曼菌属的丰度明显增加，而加味独活寄生合剂明显降低了肠道中阿克曼菌属的丰度，推测其通过调控肠道菌群抑制炎症反应，保护肠道粘膜发挥治疗作用。本研究还发现加味独活寄生合剂对肠道菌群脂肪酸、糖和氨基酸等代谢途径均有影响(P<0.05)。脂肪酸是肠道菌群及其宿主肠上皮细胞的重要能量来源，能够维持肠道酸碱平衡、修复肠黏膜损伤、缓解肠道炎症反应、调节宿主肠道免疫并抑制有害病原菌生长[15]。

综上所述，本实验结果提示通过调整肠道菌群结构并改善其代谢途径可能是加味独活寄生合剂治疗KOA的潜在机制之一。目前，基于16S rRNA 测序技术用于药物疗效评价，尤其对探讨中药复方在临床治疗疾病及其机制方面具有重要意义。但机体肠道菌群结构与组成复杂，部分菌群及其生物学意义尚无法完全检测与诠释，肠道菌群与药物及药物代谢物之间相互作用关系等未知领域还有待进一步深入研究。