艳山姜挥发油调控p62/Keap1/Nrf2信号改善糖尿病小鼠胰腺损伤

杨 红，陈婷婷，陈永鑫，宋晓妹，马 晓，张 宝，沈祥春，李 悦

(1. 贵阳市妇幼保健院(贵阳市儿童医院)药学部，贵州 贵阳 550003；2.天然药物药资源优效利用重点实验室，贵州 贵阳 550025，3.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550025)

糖尿病已成为全世界发病率最高、死亡率最高的疾病之一，是威胁人类健康的重大卫生问题。国际糖尿病联盟2020年最新统计数据表明：目前全世界至少有4.63亿成人患有糖尿病，糖尿病及其并发症已经成为21世纪全球医疗卫生的沉重负担，是目前亟待解决的重大科学及社会民生焦点问题[1]。其中2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)所占比例达到93.7%[2]。T2DM的发病机制复杂，包括恶性高血糖、胰岛素抵抗、胰岛素分泌障碍和β细胞凋亡。以上情况的发生可使糖尿病持续恶化至无法逆转，最终导致多系统组织器官功能障碍，严重影响患者生活质量和寿命[3]。临床上针对T2DM的治疗方式主要为采用外源性胰岛素注射或口服降糖药[4]，但二者应用中易出现低血糖及注射部位肌肉萎缩等副作用现象，且大部分降糖药物均是使得胰腺组织代偿性的分泌胰岛素以降低血糖，并非改善受损的胰腺功能[5]。因此，积极探索和寻找T2DM的病理生理新机制，寻找改善胰腺功能的关键靶位及防治药物，对改善患者生活质量具有重大意义。

氧化应激在糖尿病进程中发挥着重要作用，糖尿病长期存在的高血糖，可打破体内氧化还原平衡，继而引发组织器官损伤，加快糖尿病疾病的进展。p62/Keap1/Nrf2信号通路在细胞抗氧化和外源性有毒物质诱导的主要防御机制中发挥着极其重要的作用[6]。既往研究[7]显示，Keap1-Nrf2信号通路的紊乱是胰腺功能障碍的驱动力，重新激活Nrf2可有效减轻组织损伤、恢复组织的功能，对糖尿病的预防和治疗具有重要意义。

民族药艳山姜为姜科山姜属植物Alpiniazerumbet(Pers.) Burttet Smith，前期研究表明，艳山姜的主要有效成分为挥发油(essential oils fromFructusAlpiniaezerumbet，EOFAZ)，具有广泛的抗炎、抗氧化以及防治心血管系统疾病等多方面的生物活性[8]。最近课题组研究提示，EOFAZ可明显改善糖尿病视网膜病变的发生发展[9]，但其对糖尿病应激下胰腺组织损伤的作用以及作用机制尚不明确，故本研究探讨其对糖尿病诱导的小鼠胰腺组织损伤的干预作用，明确其可能的作用靶点及途径。

1 材料

1.1 实验动物60只♂ C57BL/6小鼠购自贵州医科大学动物中心，动物合格证号：SCXK(黔20180001)，实验动物使用许可证号：SYXK(黔20180001)。动物实验得到贵州医科大学伦理委员会批准(No 2000499)。小鼠饲养在贵州医科大学动物中心，室温保持在20～23 ℃，相对湿度保持在40%～70%。

1.2 药物及试剂于贵州省贞丰县采摘的艳山姜果实，经贵州医科大学药学院生药学与药用植物学教研室龙庆德副教授鉴定为姜科植物AlpiniazerumbetPers. Burttet Smith的干燥成熟果实(凭证标本号：No 20151018)，按2015年版《中国药典》(四部)通则2204挥发油测定法提取EOFAZ。收得率为1.3%。取EOFAZ，将其溶于吐温80及甘油溶液(二者分别所占总体积的10%)中，使用生理盐水补充体积。盐酸二甲双胍片购自于中美上海施贵宝制药有限公司，批号：ABV4533。链脲佐菌素购自于美国Sigma公司，批号：HMBF 4669V。p62(18420-1-AP)，Keap1(10503-2-AP)，Nrf2(16396-1-AP)，HO-1(27282-1-AP)，Bax(50599-2-Ig)，Bcl-2(12789-1-AP)，β-actin(66009-1-Ig)一抗购自Proteintech公司。

1.3 主要仪器700-SERIES超低温冰箱(Thermo 公司)，3020-426多功能全波长酶标仪(Thermo公司)，奥林巴斯荧光显微镜TS100(日本)，CFX型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，SIM-F140AY65型制冰机(日本SANYO电子有限责任公司)，自动生化仪(德国拜耳西门子公司)，5810R型冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 动物模型的建立C57BL/6小鼠适应性饲养1周，尾静脉取血、血糖仪测定小鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，FBG<11.1 mmol·L-1的小鼠随机分为为正常对照组(n=20)、糖尿病造模组(n=40)。正常对照组小鼠给予基础饲料、糖尿病造模组小鼠给予高脂高糖饲料HFS饲养2个月后，过夜禁食12 h，尾静脉取血(50～100 μL)，测定血清空腹胰岛素及血糖水平，采用稳态模型(HOMA)评价胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)，当HFS组的HOMA-IR>对照组即认为胰岛素抵抗形成，对产生胰岛素抵抗的小鼠腹腔注射STZ(120 mg·kg-1)，正常对照组注射相同体积的枸橼酸钠缓冲液，72 h后测定血糖，FBG≥11.1 mmol·L-1的小鼠即被认为实验性2型糖尿病(T2DM)模型建立成功。

2.2 分组、干预、取材将正常对照组小鼠随机分为正常组(Control)和EOFAZ毒性组(180 mg·kg-1)，T2DM小鼠随机分配为糖尿病组(DM)、EOFAZ低剂量组(90 mg·kg-1)、高剂量组(180 mg·kg-1)、二甲双胍组(250 mg·kg-1)，每组均保留10只。EOFAZ组、二甲双胍组分别灌胃EOFAZ和二甲双胍的同时，正常组和DM组以等体积生理盐水灌胃，每天一次。连续灌胃8周后处死小鼠，采血并取胰腺组织。

2.3 HE染色观察胰腺组织的病理性变化切除部分胰腺泡于4%的多聚甲醛中，用于HE染色。石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡、梯度酒精(酒精浓度为100% Ⅰ，100% Ⅱ，95% Ⅰ，95% Ⅱ，80%，75%，三蒸水)脱水，然后用苏木精染液染15 min，1%盐酸酒精溶液分化5 s，碳酸锂溶液蓝化5 s，2%伊红染液染色3 min，梯度酒精(酒精浓度分别为70%，80%，95% Ⅰ，95% Ⅱ，100% Ⅰ，100% Ⅱ)脱水。二甲苯溶液透明(切片于二甲苯Ⅰ中浸泡5 min，于二甲苯Ⅱ中浸泡5 min)，中性树胶封片，于显微镜下采集照片(400×)。

2.4 免疫印迹分析切除部分胰腺冻存于-80 ℃，取胰腺组织30 mg，加入4倍体积RIPA与PMSF(二者比例为99 ∶1)，匀浆后12 000 r·min-1的转速离心20 min，取上清，BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，用浓度为12%的SDS-PAGE凝胶试剂盒将蛋白样品(30 μg)进行电泳分离并将蛋白转移至PVDF膜。5% BSA溶液封闭2 h后与p62(1 ∶2 000)，Keap1(1 ∶1 000)，Nrf2(1 ∶2 000)、HO-1(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶2 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)一抗在4 ℃下过夜孵育。次日，膜用1× TBST洗3次后与二抗室温孵育1 h。膜洗3次后，用ECL化学发光试剂盒进行显色，用Bio-Rad凝胶成像系统进行曝光，用Image-Lab软件对数字图像进行量化。

2.5 免疫组织化学切除部分胰腺固定于4%的多聚甲醛中，采用的是PV6000 Two-Step IHC Detection Reagent二步法检测组织抗原表达。石蜡包埋、切片脱蜡、水化，3%过氧化氢室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，抗原修复，Nrf2(1 ∶200)一抗，在4 ℃下过夜孵育，孵育二抗后加入DAB染色液显色，苏木精复染后脱水，中性树脂封片。于显微镜下采集照片(400×)。

3 结果

3.1 EOFAZ对小鼠空腹血糖的影响与正常组相比，小鼠经STZ诱导后空腹血糖(FBG)明显升高，与DM组小鼠相比较，二甲双胍组小鼠FBG水平明显降低，EOFAZ对血糖无明显影响(Fig 1)。

Fig 1 Effects of EOFAZ on FBG level in

3.2 EOFAZ对T2DM小鼠胰腺组织病理形态的影响HE染色结果表明，正常组的小鼠胰腺组织较为完整，胰岛结构丰富饱满，具有完整的β细胞，排列紧密，胰岛与外分泌腺界限清楚。DM组小鼠的胰岛结构不完整，边界不均匀，模糊，内有空泡浸润。给予EOFAZ后可减轻胰腺组织的病理形态，表现为胰岛组织完整，胰岛中β细胞排列紧密(Fig 2)。

Fig 2 Effects of EOFAZ on pathological observation of pancreatic tissues in mice(HE×400)

Fig 3 Effects of EOFAZ on expression of p62，Keap1，Nfr2 and Ho-1 in

3.3 EOFAZ对小鼠胰腺组织p62，Keap1，Nrf2 及Ho-1蛋白表达的影响与正常组相比较，DM组小鼠胰腺组织中Keap1蛋白表达明显增加，Nrf2、Ho-1、p62蛋白表达明显降低(P<0.05)。给予EOFAZ后，与DM组相比较，可明显下调Keap1蛋白表达并上调Nrf2、Ho-1、p62蛋白表达(Fig 3)。免疫组织化学结果显示，与正常组小鼠胰腺组织相比较，胰腺组织中Nrf2蛋白表达降低。给予EOFAZ后，可明显上调Nrf2的表达(Fig 4)。

Fig 4 Effects of EOFAZ on expression of Nrf2 in pancreatic tissues (400×)

3.4 EOFAZ对小鼠胰腺组织凋亡信号Bax，Bcl-2蛋白表达的影响与正常组相比较，DM组小鼠胰腺组织中Bax蛋白表达明显增加，Bcl-2蛋白表达明显降低。给予EOFAZ后，与DM组相比较，可明显下调Bax蛋白表达并上调Bcl-2蛋白表达(Fig 5)。

Fig 5 Effects of EOFAZ on expression of Bax and Bcl-2 in pancreatic tissues

4 讨论

糖尿病是一类由于胰岛素分泌缺陷及(或)其生物作用障碍而引起的，以慢性高血糖为主要特征的临床综合征[10]。糖尿病主要分为1型糖尿病(diabetes mellitus type 1，T1DM)和2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)，T1DM的特点是机体胰岛功能完全丧失，T2DM的主要特点是由于胰岛细胞胰岛素分泌不足或是机体产生胰岛素抵抗导致无法控制升高的血糖，使糖尿病持续恶化至无法逆转。长期存在的高血糖可诱导组织脏器功能损伤，严重影响患者生活质量和寿命，给家庭及社会带来沉重的负担[11]。中药在治疗流行性疾病如心血管疾病和糖尿病等已取得较为可观的结果[12]。民族药艳山姜为姜科山姜属植物Alpiniazerumbet(Pers.) Burttet Smith，已被收录于2003版《贵州省中药、民族药标准》。课题组前期研究显示，艳山姜的主要有效成分为挥发油(EOFAZ)，具有抗炎、抗氧化应激等生物活性。最新研究显示EOFAZ对糖尿病视网膜病变具有明显的改善作用。提示EOFAZ对糖尿病并发症具有明显的改善作用[9]。在本研究中，高糖高脂饲料饲养小鼠产生胰岛素抵抗后，通过腹腔注射STZ成功建立T2DM小鼠模型。小鼠胰腺HE染色病理性观察结果表明，EOFAZ可明显改善糖尿病诱导的胰腺组织损伤。

随着对T2DM的不断深入研究，发现高血糖应激状态下，可导致胰腺组织氧化与抗氧化系统失衡。高血糖诱导的氧化应激损伤及胰岛β细胞凋亡是T2DM发生发展的最关键因素[13]。因此，寻找能有效改善胰腺氧化应激损伤的药物尤为迫切。核因子E2相关因子2(nuclear factor -E2-related factor 2，Nrf2)是广为人知的抗氧化防御的关键转录因子。正常生理状态下，Nrf2由Keap1锚定，并在泛素化后被26S蛋白酶体快速降解，从而维持Nrf2在胞质-胞核中的表达平衡[14]，当机体氧化还原系统作用失衡发生氧化应激损伤时，Nrf2与Keap1解离后可由胞质转移到胞核，激活抗氧化基因如血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)等的表达[15]，从而发挥抗氧化作用，保护胰腺组织。p62是自噬常见的生物标志物之一，参与细胞内溶酶体的运输和蛋白酶体降解泛素化过程，是Keap1/Nrf2通路上游重要的调控因子。p62蛋白表达上调可竞争性结合Keap1，抑制Nrf2泛素化，维持胞质胞核中Nrf2水平的稳定，从而诱导下游抗氧化基因的表达[16]。本研究发现，给予EOFAZ后，可明显上调p62的表达，抑制Nrf2的降解，降低Keap1蛋白表达，促进下游抗氧化基因HO-1的转录，从而发挥抗氧化应激的作用。

胰腺组织损伤是导致β细胞功能障碍直至凋亡的关键因素。β细胞作为分泌胰岛素调节血糖的重要细胞，对氧化应激损伤高度敏感。Bcl-2家族由抗凋亡蛋白(Bcl-2)和促凋亡蛋白(Bax)组成。氧化应激损伤发生时，促凋亡蛋白表达(如Bax)异常上调、抗凋亡蛋白(如Bcl-2)异常下调后可激活凋亡信号通路，从而诱发β细胞凋亡[17]。本研究结果表明，EOFAZ可明显下调DM小鼠胰腺组织中Bax的表达，上调Bcl-2的表达。

综上所述，EOFAZ对DM诱导的胰腺组织损伤具有明显改善作用，其作用与活化p62/Keap1/Nrf2信号并促进其下游抗氧化基因表达，从而抑制凋亡相关，本研究为后期更进一步研究EOFAZ改善胰腺组织损伤，恢复胰腺功能提供实验依据。为民族药艳山姜防治糖尿病开拓新的理论指导与实验基础，对促进民族药研究的现代化具有重要的社会意义。