生物制品用辅料蔗糖中颗粒杂质体外补体激活研究

王珏，江颖，肖新月，杨锐，孙会敏

(1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.上海市医疗器械化妆品审评核查中心，上海 200020)

药用辅料蔗糖常用于生物制品的冷冻干燥配方中，是最常用且用量很大的保护剂。近年来，生物制品引发的免疫反应受到社会关注[1-3]，但现有的研究很少区分这种不良的免疫反应是制剂或是辅料本身引起。据报道，辅料中可能引入的颗粒杂质是产生免疫应答不良反应的风险因素之一[4-5]。

补体系统是机体抗感染的第一道防线，是固有免疫的重要组成部分，主要参与非特异性免疫，在感染早期能迅速通过经典途径、旁路途径或凝集素途径被活化，作用过程中可产生攻膜复合物以及 C3a 和 C5a 等关键中间产物，具有溶解细胞作用、调理作用、炎症介质作用、清除免疫复合物作用及免疫调节作用。非常低的补体浓度即可诱导强烈的免疫效应，并参与炎症和过敏反应。其中，过敏毒素C3a和C5a两种信号分子能够引起血管扩张，调节细胞因子的产生，引起组胺的释放和氧化爆发，并作为天然免疫细胞趋化的信号，影响促炎和过敏反应的程度，产生过敏反应性临床表现。C4a的产生是补体通过经典或凝集素途径激活的标志。Bb因子是B因子的可溶性副产物，也是补体通过旁路途径活化的特异性标志物[6]。过敏反应、类过敏反应和增加(不希望的)抗体反应都可由补体激活引起。

巨噬细胞属于单核-巨噬细胞系统，在机体组织中广泛存在，是机体免疫防御、免疫自稳、免疫监视中的重要组成部分。在机体的获得性免疫和先天性免疫中均有着至关重要的作用。本文通过建立体外巨噬细胞补体激活模型，对蔗糖中的颗粒杂质进行提取制备并进行粒径分析，发现该微粒的粒径为100～300 nm；颗粒杂质可促进C3a的产生，激活C5转化酶，产生C5a；C4a和Bb含量相比空白对照均有增加，证明该微粒可通过经典途径、甘露糖凝集素途径或旁路途径激活补体。不同厂家蔗糖的补体激活程度不同。

1 材料与试剂

1.1 仪器 纳米颗粒跟踪分析仪(Particle Metrix，ZetaView)；切向流超滤系统(PALL，Minimate EVO)；离心过滤器(Millipore，Amicon Ultra 15)；冻干机(北京博医康实验仪器有限公司，FD-1A-50)；CO2培养箱(Thermo Fisher，Forma 371)；倒置荧光显微镜(Olympus Corporation，IX53)；离心机(Thermo Fisher，Multifuge X3R)；酶标仪(Molecular Devices，SpectraMax M2e)。

1.2 材料和试剂 蔗糖：A公司(批号：40482A)，编号：Suc-1；B公司(批号：191105)，编号：Suc-2；C公司(批号：102420190601)，编号：Suc-3；D公司(批号：20200207)，编号：Suc-4。PBS缓冲液、1640培养液、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)均来自Gibco公司；Ficoll单个核细胞分离液(GE Healthcare)；去离子水；鲎试剂(50-0.005 EU·mL-1，Charles River)；细菌内毒素检查用水(Charles River)；细菌内毒素标准品(9 000 EU·mL-1，中国食品药品检定研究院)；人补体片段3a(C3a)ELISA试剂盒；人补体片段4a(C4a)ELISA试剂盒；人补体片段5a(C5a)ELISA试剂盒；人补体片段Bb(CBb)ELISA试剂盒。

1.3 细胞 人骨髓来源巨噬细胞，购自武汉普诺赛生命科技有限公司，用Procell人骨髓来源巨噬细胞专用完全培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

2 方法

2.1 蔗糖中颗粒杂质的制备和粒径测定

2.1.1 不溶性颗粒物的提取和制备 取蔗糖适量，精密称定，置100 mL容量瓶中，加去离子水溶解并稀释至刻度，制得浓度为100 mg·mL-1的溶液。用切向流过滤系统进行浓缩，用针对超纯水的渗滤去除蔗糖，直到达到15倍于样本溶液体积的透析液。将透析液通过微孔滤膜滤过，以3 000 r·min-1的速率离心10 min进一步浓缩液[7]，标记为NPI溶液。另取去离子水100 mL同法处理，作为空白对照。

2.1.2 颗粒杂质粒径测定 采用纳米颗粒跟踪分析仪测定粒径及其分布。

2.2 细菌内毒素的检测 取1支细菌内毒素国家标准品，加入细菌内毒素检查用水1 mL，涡旋混匀15 min，得到9 000 EU·mL-1的内毒素标准溶液，将该溶液稀释得0.5～1 000 EU·mL-1的系列标准品溶液。另取蔗糖样品适量，加内毒素检查用水稀释得25 mg·mL-1的溶液，分别按5倍和10倍稀释。取10倍稀释液和0.125 EU·mL-1的内毒素标准溶液以1∶1混合，涡旋混合30 s得阳性对照溶液。参照《中国药典》2020年版(四部)[8]通则1143方法1 凝胶法进行测定。

2.3 巨噬细胞补体激活体外模型探究蔗糖颗粒杂质的补体激活途径

2.3.1 样品溶液的配制 精密称取蔗糖适量，以PBS为溶剂，制得浓度分别为1、0.1、0.01 mg·mL-1的样品溶液。取提取制备的颗粒杂质溶液，过滤除菌，稀释得到108、107、106个/mL 3个工作浓度的样品溶液。

2.3.2 人骨髓来源巨噬细胞的培养 人骨髓来源巨噬细胞，以Procell人骨髓来源巨噬细胞专用完全培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

2.3.3 补体激活模型的建立 细胞培养24 h，状态稳定后，加入100 μL不同工作浓度的各样品溶液，设置3个复孔。12 h后收集上清，1 000 r·min-1离心20 min。将所获上清液用于ELISA检测含量。

2.3.4 ELISA法测定上清液中C3a、C4a、C5a、Bb含量 采用ELISA法测定培养上清液中的补体含量,操作步骤按C3a、C4a、C5a、Bb试剂盒说明书进行测定，用酶标仪读取450 nm波长处吸光度值。

2.4 统计学方法 实验结果均以平均值±标准差(mean±SD)表示，用IBM SPSS Statistics 25对数据进行分析，组间差异采用One-way ANOVA进行统计学分析，P≤0.05时认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 样品中细菌内毒素的检测 细菌内毒素是革兰阴性细菌的细胞壁成分，可引起发热等炎症表现，其主要成分为脂多糖(LPS)。LPS活化的巨噬细胞其补体释放含量会增加。鲎试剂法对待测样品的细菌内毒素含量检测试验结果表明，本试验待测样本中的细菌内毒素含量均低于0.005 EU·mg-1。即样品中内毒素污染较小，可排除假阳性的可能，免疫应答是由于样品本身的刺激而导致。

3.2 颗粒杂质的粒径及其分布 对提取得到的蔗糖中杂质颗粒进行尺寸和数量的测定，结果见图1。由图1A可知不同厂家蔗糖中颗粒杂质的粒径及其分布均有所差异，单位体积所含有的颗粒数不同，但总体来说，粒径分布在80～300 nm之间。图1B是制备的颗粒杂质的粒子成像图，在纳米颗粒跟踪仪的测试下该颗粒可以直观显示并被追踪。据文献报道，该颗粒杂质由葡聚糖、灰分和芳香族着色剂组成，在糖精制过程中没有完全去除[9]。

A.粒径及其分布的比较图；B.制备的颗粒杂质成像图图1 提取制备的颗粒杂质及不同厂家蔗糖中颗粒杂质的粒径及其分布

3.3 补体激活途径 已有研究表明一些纳米颗粒可能诱导补体激活[10]，其活化的程度和机制取决于多种因素，包括纳米粒子的大小、表面特征和形态[11-12]。由图2可知，来自蔗糖的颗粒杂质可促进C3a的产生，C3a是C3蛋白被C3转换酶复合体裂解后产生的一种过敏性毒素，随后在补体末端途径中达到顶峰：激活C5转化酶，开始产生C5a。C4a和Bb含量相比空白对照均有一定程度的增加，因此该颗粒杂质能够激活体外巨噬细胞补体系统，其途径可能有经典途径、甘露糖凝集素途径或旁路途径。

图2 ELISA方法测定蔗糖中颗粒杂质激活各补体的含量在对不同厂家来源的蔗糖溶液

分别取浓度为0.01、0.1和1 mg·mL-1的不同厂家的蔗糖配制的溶液与巨噬细胞共孵育，用ELISA法测定上清液中C3a、C5a、Bb和C4a的含量，结果如图3所示。与对照相比，不同厂家的蔗糖溶液均可以引起显著的补体激活效应，其中A厂家的产Suc-1处理后的巨噬细胞产生了较高含量的C3a、C5a、Bb和C4a，这可能与其中颗粒杂质的粒径较大有关。

图3 不同厂家的蔗糖产品促进补体激活的比较

4 讨论

蔗糖中存在的颗粒杂质粒径约为80～300 nm之间，这部分颗粒有可能激活补体系统，存在免疫应答风险造成用药安全隐患。为减少其中的纳米颗粒杂质，生产者可通过使用小孔径过滤器(例如0.02 μm)过滤除去纳米颗粒杂质，也可改进生产工艺并制定相关的内控标准，对高风险给药途径用的蔗糖中纳米颗粒杂质进行合理控制。