复方苦参注射液对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖和凋亡的影响Δ

刘 蕊，范宁建，王英曼，宋 洁，张 岩

(1.华北理工大学附属医院肿瘤放化疗科，河北 唐山 063000； 2.唐山市第二医院脊柱三科，河北 唐山 063000)

多发性骨髓瘤是起源于骨髓中浆细胞的恶性肿瘤，目前多采取化疗、免疫治疗及骨髓移植等治疗。骨髓移植为唯一治愈方法，但受供体、年龄及经济条件的限制，疾病缓解率低，且容易产生耐药。复方苦参注射液是从纯中药中提取的抗肿瘤制剂，近年来被广泛用于结肠癌、乳腺癌、食管癌和肺癌等恶性肿瘤的治疗，效果显著[1-8]。但复方苦参注射液能否起到抑制骨髓瘤细胞增殖和侵袭的作用，目前尚不明确。为此，本研究以骨髓瘤RPMI8226细胞为对象，分析复方苦参注射液对骨髓瘤细胞增殖和侵袭的调控作用及其机制，为深入研究复方苦参注射液的抗肿瘤作用提供理论依据。

1 材料

1.1 细胞

骨髓瘤RPMI8226细胞系购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2 仪器

Transwell小室(美国Corning公司)；FACSCelesta型流式细胞仪(美国BD公司)；ELx808型酶标仪(美国Bio-TEK公司)。

1.3 药品与试剂

复方苦参注射液(山西振东制药公司，批准文号为国药准字Z14021231，规格为每支装5 mL)；四甲基偶氮唑盐(MTT)、酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；凋亡、细胞周期试剂盒(上海前尘生物科技有限公司)；MEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清(美国Gibco公司)。

2 方法

2.1 MTT法检测复方苦参注射液对RPMI8226细胞增殖的影响

收集对数生长期骨髓瘤RPMI8226细胞，接种于96孔板上，5×104/mL，每孔100 μL。孵育24 h，加入不同浓度(0.5、1、2、5和10 mg/mL)的复方苦参注射液100 μL，设置5个平行复孔。同时设置阴性对照组(细胞100 μL，培养液100 μL)和空白对照组(培养液200 μL)。孵育24、48 h后每孔加入MTT 20 μL，继续孵育4 h，按照试剂盒方法进行处理，以酶标仪检测490 nm处吸光度(A)，计算5个复孔的平均值。分别计算给药后24、48 h细胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=[1-(给药组平均吸光度-空白组平均吸光度)/(对照组平均吸光度-空白组平均吸光度)]×100%。

2.2 复方苦参注射液对RPMI8226细胞凋亡及细胞周期的影响

选择增殖抑制率>50%的高浓度复方苦参注射液(5、10 mg/mL)为实验组，设置5个平行对照，同时设置阴性对照组(加入等量的细胞)。孵育48 h，按照试剂盒方法处理，进行流式细胞仪检测。

2.3 血清白细胞介素6(IL-6)水平检测

以不同浓度复方苦参注射液(0、5和10 mg/mL)处理RPMI8226细胞48 h，按照ELISA试剂盒方法处理。记录酶标仪450 nm波长处测吸光度(A)，计算IL-6水平。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 复方苦参注射液对RPMI8226细胞的增殖抑制作用

MTT法结果显示，与对照组相比，复方苦参注射液各浓度组RPMI8226细胞的增殖被显著抑制，抑制作用增强呈剂量和时间依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 细胞抑制率测定结果

3.2 复方苦参注射液对RPMI8226细胞凋亡的影响

与阴性对照组相比，复方苦参注射液5 mg/mL组、复方苦参注射液10 mg/mL组G0/G1期细胞比例显著升高，而S期细胞比例显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。药物浓度提高后，细胞凋亡率明显升高，复方苦参注射液5 mg/mL组与复方苦参注射液10 mg/mL组的差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、表2。

表2 细胞周期及凋亡率测定结果

A.阴性对照组；B.复方苦参注射液5 mg/mL组；C.复方苦参注射液10 mg/mL组

A.阴性对照组；B.复方苦参注射液5 mg/mL组；C.复方苦参注射液10 mg/mL组

3.3 复方苦参注射液对IL-6表达水平的影响

阴性对照组、复方苦参注射液5 mg/mL组和复方苦参注射液10 mg/mL组细胞IL-6表达水平分别为(23.97±1.87)、(15.29±1.02)和(10.34±0.88)ng/L。与阴性对照组相比，复方苦参注射液各浓度组细胞IL-6表达水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；随着药物浓度的增加，IL-6表达水平逐渐降低，复方苦参注射液5 mg/mL组与复方苦参注射液10 mg/mL组的差异有统计学意义(P<0.05)。

4 讨论

多发性骨髓瘤为血液系统恶性肿瘤，常规治疗方案缓解率较低，故寻求及时有效的治疗尤为重要。复方苦参注射液为纯中药制剂，具有清热利湿、凉血解毒、止痛止血的功效，具有提高化疗效果和免疫功能的作用[9-10]。分子机制研究结果表明，复方苦参注射液能通过抑制细胞周期调节蛋白和DNA修复蛋白水平，提高DNA双链断裂基因蛋白水平，诱导宫颈癌细胞凋亡[11]。另外，Gao等[12]研究结果发现，复方苦参注射液可通过MMP2、MYC、CASP3和REG1A等靶点以及抑制葡萄糖、氨基酸代谢途径发挥抗肝癌作用。研究结果显示，复方苦参注射液可通过减少肿瘤组织中的血管生成来抑制小鼠肝癌细胞生长，平衡转化生长因子β/Smad7信号，预防肝癌发生[13-14]；并通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、雷帕霉素靶蛋白和Janus激酶/信号转导与转录激活子等信号通路，起到治疗胃癌和肝癌的作用[15-16]；亦可通过Prdxs/ROS/Trx1信号通路，在急性白血病治疗中发挥重大作用[17]。因此，作为一种潜在的抗肿瘤药，复方苦参注射液的作用机制值得深入研究。本研究以骨髓瘤RPMI8226细胞株为研究对象，探讨复方苦参注射液对其增殖和侵袭能力的影响，并分析潜在的抗肿瘤作用机制，以期为多发性骨髓瘤的治疗开辟新途径。

本研究结果发现，复方苦参注射液浓度从5 mg/mL增至10 mg/mL，作用时间从24 h增至48 h，对RPMI8226细胞增殖抑制作用均呈升高趋势，随着药物浓度增加，细胞凋亡率升高，细胞周期阻滞于G1期，提示苦参注射液能参与诱导骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡。多发性骨髓瘤发病机制复杂，免疫因素在疾病发生发展中的作用已得到广泛共识[18]。既往研究结果显示，IL-6在体内外均可促进恶性肿瘤细胞的增殖。多发性骨髓瘤患者血清中IL-6水平显著升高，且与肿瘤负荷密切相关，是骨髓瘤患者独立预后因素之一[19-20]。本研究中，复方苦参注射液可降低IL-6表达水平，提示复方苦参注射液可能通过抑制IL-6的表达从而起到抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用。进一步验证了复方苦参注射液的抗肿瘤活性及发挥抗骨髓瘤作用的分子机制。但复方苦参注射液在多发性骨髓瘤发生发展中的具体作用和分子机制尚不清楚，仍需通过分子生物学实验进一步研究证实。

综上所述，复方苦参注射液对骨髓瘤RPMI8226细胞增殖具有抑制作用，且该作用与抑制IL-6表达、参与调节多发性骨髓瘤相关免疫微环境有关。