虫草益肾颗粒对高糖条件下肾小球系膜细胞氧化应激及p22phox表达的影响

刘爽 宋立群

1.浙江中医药大学附属第三医院 杭州 310005 2.黑龙江中医药大学

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是终末期肾脏病（end stage renal disease，ESRD）的主要原因，30%～40%的糖尿病患者会发生DKD[1]。有研究发现，DKD病理改变的主要原因是人肾小球系膜细胞（human glomerular mesangial cells，HMCs）的异常增殖[2]，因此本研究以HMCs作为研究对象。氧化应激反应在DKD的发生发展中起着重要作用，氧化应激的增强可导致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的过量产生，引起中性粒细胞发生炎性浸润，产生大量氧化中间产物，最终导致组织细胞损伤[3-6]。生理情况下，ROS的清除与生成处于一种动态平衡状态；而在病理情况下，当组织中生成的ROS超过了抗氧化系统的清除能力时，就会发生氧化应激反应。肾脏中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是参与ROS生成的主要氧化酶之一[7]，p22phox是NADPH氧化酶的亚单位，主要存在于细胞膜上，当NADPH氧化酶激活后，p22phox表达升高，并在短时间内产生大量的ROS。因此，抑制NADPH氧化酶表达可以抑制ROS产生，从而避免氧化应激反应造成的肾脏损伤，并最终抑制DKD进一步发展[8-10]。虫草益肾颗粒为宋立群教授应用多年的临床经验方，在治疗DKD方面疗效显著。前期研究发现，虫草益肾颗粒可通过抑制自由基引起的脂质过氧化反应，促进过氧化氢酶（catalase，CAT）的活性，从而提高机体抗氧化能力[11]。本研究通过观察虫草益肾颗粒含药血清对高糖条件下HMCs增殖和氧化应激的影响，进一步探究虫草益肾颗粒防治DKD的作用机制，为虫草益肾颗粒治疗DKD提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性无特定病原体 （specific pathogen free，SPF）级Wistar大鼠50只，10周龄，体质量200～220 g，购买并饲养于黑龙江中医药大学实验中心[实验动物使用许可证号码：SYXK（黑）2017-010]。实验动物的使用严格按照《关于善待实验动物的指导性意见》的有关规定进行。

1.2 干预药物 虫草益肾颗粒组成：生黄芪30 g、制大黄10 g、水蛭3 g、猫须草20 g、虫草菌丝粉10 g，所有中药购于黑龙江中医药大学附属第一医院中药房。将上方煎煮、浓缩后制成颗粒剂，规格为12 g/袋。福辛普利购于黑龙江中医药大学附属第一医院西药房（商品名：蒙诺，规格：10 mg/片，批号：1705054）。

1.3 主要试剂和仪器 洛斯维尔·帕克纪念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）1640培养液及胎牛血清均购于Gibco公司（批号：11875-093、10091-148）；细 胞 增 殖 检 测 （cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒购于Biosharp公司（批号：BS350B）；葡萄糖干粉购于Sigma公司（批号：G7528）；总RNA提取试剂购于上海拜力生物科技有限公司（批号：BL201704）；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）试剂盒购于深圳市康百得生物科技有限公司（批号：20170428）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒购于哈尔滨海基公司 （批号：20160516）；p22phox抗体购于Abcam公司 （批号：ab75941）。 Mini-Opticon2型PCR仪购于美国应用生物系统公司；EPICSXL型流式细胞仪为美国Beckmann Coulter公司产品；UVP-200凝胶成像系统购于美国UVP公司；Multiskan 354酶标仪为芬兰Labsystems公司产品。

1.4 方法

1.4.1 虫草益肾颗粒含药血清的制备 50只大鼠适应性喂养7 d，随机分为正常组，福辛普利组，虫草益肾颗粒高、中、低剂量组，每组10只。根据《药理实验方法学》[12]计算得出大鼠福辛普利的成人临床等效剂量为0.9 mg·kg-1，以成人临床等效剂量为虫草益肾颗粒低剂量组，中剂量组与高剂量组分别为低剂量组的2倍和4倍。正常组予0.9%氯化钠溶液灌胃，福辛普利组以0.9mg/（kg·d）灌胃，虫草益肾颗粒低、中、高剂量组分别以3.24 mg/（kg·d）、6.48 mg/（kg·d）、12.96 mg/（kg·d）灌胃。各组大鼠饲养环境及条件相同，持续干预7 d后，于末次给药后2 h眼眶取血，3 000 r·min-1离心15 min，分离血清，56℃、30 min灭活，无菌条件下过滤除菌，分装后-80℃保存备用。

1.4.2 细胞培养 HMCs由哈尔滨医科大学附属第二医院惠赠，于37℃含5% CO2的培养箱中培养，培养至对数生长期时开始实验。

1.4.3 分组与给药 将HMCs随机分为6组：正常组，高糖组（加入30 mmol·L-1葡萄糖），福辛普利组（加入10%福辛普利组大鼠含药血清），虫草益肾颗粒低、中、高剂量组（分别加入10%虫草益肾颗粒低、中、高剂量组大鼠含药血清）。

1.4.4 指标检测

1.4.4.1 细胞增殖检测 以CCK-8试剂盒检测各组细胞的增殖情况。将对数生长期HMCs接种于96孔板，调节细胞密度为7～8×103/孔，每孔100 μL，置于37℃、5% CO2培养箱。每个时间点分别设10个复孔，培养至24、48、72 h时，分别加入10 μL/孔的CCK-8溶液，继续孵育4 h。4 h后取出，酶标仪检测450 nm波长处吸光度。

1.4.4.2 各组细胞ROS的表达情况 HMCs以1×105个/mL接种于6孔板，于培养箱中培养48、72 h后，以流式细胞仪检测各组ROS水平。

1.4.4.3 Real-time qPCR检测各组细胞p22phox的mRNA表达 收集细胞，提取RNA并定量，根据试剂盒说明书将所获得的RNA逆转录为cDNA，以β-actin为内参，进行扩增，反应条件为95℃ 15 min，95℃10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环，每个样品各设3个复孔，以2-△△ct计算mRNA的相对表达量。引物设计和合成均由日本Takara公司完成，序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4.4.4 免疫印迹法检测各组细胞p22phox的蛋白表达 收集细胞，提取总蛋白并进行蛋白定量后，按每孔50 μg上样，行十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳 （sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳，转膜后以5%脱脂奶粉配制的含有Tween的tris缓冲液（tris buffer solution Tween，TBST）封闭1 h，加入一抗（稀释比例：1∶1 000），室温摇床孵育2 h后洗涤3次；加入二抗（稀释比例：1∶5 000），孵育1 h后洗涤3次，以β-actin作为内参，加入电化学发光液显色1 min，摄片扫描后用Image-Pro Plus 5.0软件计算条带相对灰度值。

1.5 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，以GraphPad Prism 5.0软件进行图表处理。计量资料以±s表示，不同组同一时间点及同一组不同时间点差异比较采用单因素方差分析，多个样本均数间两两比较采用最小显著差异法（least significant difference-t，LSD-t）检验。 以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常组与高糖组细胞不同时间点增殖情况比较

随着培养时间延长，正常组和高糖组细胞数量明显增加，各时间点比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。其中，正常组和高糖组在48 h时的增速均最高，随后便进入增殖平台期，速度逐渐趋于平缓；在各个时间段内，高糖组HMCs增殖速度始终高于正常组，不过在48～72 h时间段内，高糖组的HMCs增殖速度与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 正常组与高糖组细胞不同时间点增殖情况比较Fig.1 Comparison of cell proliferation between normal group and high glucose group at different time points

干预24 h后，与高糖组比较，虫草益肾颗粒低、中剂量组及福辛普利组的HMCs增殖水平差异无统计学意义（P＞0.05），而虫草益肾颗粒高剂量组的HMCs增殖水平明显低于高糖组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明干预24 h后，虫草益肾颗粒高剂量组对HMCs增殖的抑制效果明显。干预48、72 h后，与高糖组比较，虫草益肾颗粒低、中、高剂量组及福辛普利组均明显抑制了HMCs增殖，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。 见表2。

表2 各组细胞增殖比较Tab.2 Comparison of proliferation in each group（±s，n=10）

表2 各组细胞增殖比较Tab.2 Comparison of proliferation in each group（±s，n=10）

注：与正常组同时点比较， ##P＜0.01；与高糖组同时点比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。Note:Compared with normal group at the same time， ##P＜0.01;compared with high glucose group at the same time， ▲P＜0.05， ▲▲P＜0.01.

组别 2 4 h 4 8 h 7 2 h正常组 0.3 3 9±0.0 8 5 0.9 7 5±0.1 3 6 0.9 8 8±0.0 9 4高糖组 0.6 6 3±0.1 0 8## 1.3 7 3±0.0 9 8## 1.3 9 3±0.0 6 9##福辛普利组 0.5 7 3±0.1 1 9## 1.2 1 5±0.1 0 8##▲▲ 1.1 1 1±0.1 2 2##▲▲虫草益肾颗粒低剂量组 0.6 3 3±0.1 0 0## 1.2 5 1±0.1 1 7##▲ 1.2 0 6±0.0 5 1##▲▲虫草益肾颗粒中剂量组 0.6 1 4±0.0 9 9## 1.2 2 1±0.1 1 6##▲ 1.1 4 9±0.0 6 9##▲▲虫草益肾颗粒高剂量组 0.5 1 5±0.0 5 5##▲ 1.1 8 4±0.0 9 3##▲▲ 1.0 9 6±0.0 5 9##▲▲

2.2 各组细胞ROS表达比较 与正常组比较，相同时点高糖组的ROS表达量明显增高（P＜0.01）。与高糖组比较，各药物干预组ROS表达量明显降低（P＜0.01），表明药物干预有效。与福辛普利组比较，干预48 h后，虫草益肾颗粒各剂量组ROS表达差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），其中高剂量组的ROS表达量低于福辛普利组，表明虫草益肾颗粒高剂量组疗效相比福辛普利组更佳；干预72 h后，虫草益肾颗粒中、高剂量组的ROS表达量均低，且差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），表明随着药物干预时间延长，中、高剂量的虫草益肾颗粒组抑制ROS表达的效果高于福辛普利组。见表3。

表3 各组细胞ROS表达比较Tab.3 Comparison of ROS expression in each group （±s，n=6）

表3 各组细胞ROS表达比较Tab.3 Comparison of ROS expression in each group （±s，n=6）

注：与正常组同时点比较，##P＜0.01；与高糖组同时点比较，▲▲P＜0.01；与福辛普利组同时点比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note:Compared with normal group at the same time， ##P＜0.01;compared with high glucose group at the same time， ▲▲P＜0.01;compared with Fosinopril group at the same time， △P＜0.05， △△P＜0.01.

R O S/%4 8 h 7 2 h正常组 6.4 5±0.6 2 8.4 7±1.3 3高糖组 2 7.1 5±1.9 9## 3 0.4 5±2.1 5##福辛普利组 1 3.4 8±1.1 0##▲▲ 1 7.5 8±0.7 0##▲▲虫草益肾颗粒低剂量组 1 7.4 3±0.7 8##▲▲△△ 2 0.1 5±1.7 1##▲▲△△虫草益肾颗粒中剂量组 1 5.1 3±1.4 0##▲▲△ 1 5.6 3±1.2 4##▲▲△虫草益肾颗粒高剂量组 1 0.4 8±1.0 5##▲▲△△ 1 3.6 0±1.3 1##▲▲△△组别

2.3 各组细胞p22phox的mRNA表达比较 与正常组比较，相同时点高糖组p22phox mRNA表达水平明显升高（P＜0.01）；与高糖组比较，各药物干预组p22phox mRNA表达水平均下降（P＜0.01），其中虫草益肾颗粒高剂量组和福辛普利组的效果最为明显。干预48 h后，与福辛普利组比较，虫草益肾颗粒高剂量组p22phox mRNA表达水平较高，但差异没有统计学意义（P＞0.05）。干预72 h后，与福辛普利组比较，虫草益肾颗粒高剂量组p22phox mRNA表达水平低于福辛普利组（P＜0.01），而虫草益肾颗粒中剂量组差异无统计学意义 （P＞0.05），虫草益肾颗粒低剂量组p22phox mRNA表达水平高于福辛普利组（P＜0.01）。见表4。

表4 各组细胞p22phox的mRNA表达比较Tab.4 Comparison of p22phox mRNA expression in each group （±s，n=3）

表4 各组细胞p22phox的mRNA表达比较Tab.4 Comparison of p22phox mRNA expression in each group （±s，n=3）

注：与正常组同时点比较，##P＜0.01；与高糖组同时点比较，▲▲P＜0.01；与福辛普利组同时点比较，△△P＜0.01。Note:Compared with normal group at the same time， ##P＜0.01;compared with high glucose group at the same time， ▲▲P＜0.01;compared with Fosinopril group at the same time， △△P＜0.01.

p 2 2 p h o x m R N A 4 8 h 7 2 h正常组 1.0 1 9±0.0 3 6 1.0 1 3±0.0 2 5高糖组 1.7 7 1±0.0 5 5## 2.1 4 7±0.0 6 1##福辛普利组 1.3 0 9±0.0 9 3##▲▲ 1.6 1 2±0.0 1 5##▲▲虫草益肾颗粒低剂量组 1.5 6 2±0.0 4 3##▲▲△△ 1.7 2 2±0.0 3 2##▲▲△△虫草益肾颗粒中剂量组 1.4 7 7±0.0 5 1##▲▲△△ 1.6 2 6±0.0 3 0##▲▲虫草益肾颗粒高剂量组 1.3 4 7±0.0 7 5##▲▲ 1.5 2 2±0.0 2 4##▲▲△△组别

2.4 各组细胞p22phox的蛋白表达比较 与正常组比较，相同时点高糖组p22phox蛋白表达水平升高（P＜0.01）；与高糖组比较，各药物干预组蛋白表达下降（P＜0.01）。与福辛普利组比较，干预48 h后，虫草益肾颗粒低、中、高剂量组p22phox蛋白表达均升高（P＜0.01，P＜0.05）；干预72 h后，虫草益肾颗粒高剂量组p22phox蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），而虫草益肾颗粒低、中剂量组蛋白表达高于福辛普利组（P＜0.01）。 见表5。

表5 各组细胞p22phox的蛋白表达比较Tab.5 Comparison of p22phox protein expression in each group （±s，n=3）

表5 各组细胞p22phox的蛋白表达比较Tab.5 Comparison of p22phox protein expression in each group （±s，n=3）

注：与正常组同时点比较，##P＜0.01；与高糖组同时点比较，▲▲P＜0.01；与福辛普利组同时点比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note:Compared with normal group at the same time， ##P＜0.01;compared with high glucose group at the same time， ▲▲P＜0.01;compared with Fosinopril group at the same time， △P＜0.05， △△P＜0.01.

p 2 2 p h o x蛋白4 8 h 7 2 h正常组 0.1 0 0±0.0 0 2 0.2 6 4±0.0 0 6高糖组 1.0 0 5±0.0 4 7## 1.0 0 1±0.0 4 9##福辛普利组 0.2 2 3±0.0 3 8##▲▲ 0.4 3 2±0.0 1 5##▲▲虫草益肾颗粒低剂量组 0.4 6 6±0.0 3 5##▲▲△△ 0.7 9 9±0.0 1 9##▲▲△△虫草益肾颗粒中剂量组 0.4 6 4±0.0 3 2##▲▲△△ 0.6 9 2±0.0 2 7##▲▲△△虫草益肾颗粒高剂量组 0.2 9 7±0.0 2 7##▲▲△ 0.4 6 6±0.0 1 7##▲▲组别

3 讨论

DKD在中国古代医籍中没有相同病名的记载，但是与DKD症状类似的病症记载却并不少，如古代医籍中关于“肾消”或“消肾”的论述就与DKD的症状相类似。当然，这些论述只是与DKD某个阶段的症状相似，DKD发展到中后期，会出现水肿、少尿以及贫血等多种症状，又与古代医籍中的“水肿”“淋证”“虚劳”等相似。现代中医认为，该病病机为肾虚，肾虚影响三焦气化而产生瘀血、痰湿以及浊毒等病理产物，这些病理产物互为表里，相互影响，导致病情迁延难愈[13-14]。本研究团队认为，DKD的病机多为本虚标实，以脾肾亏虚为本，以痰瘀互结为标，三焦气机壅滞不通，气化功能失常，引起脏腑升降失司而致病，故治疗上应注意调畅气机，通利三焦[15]。宋立群教授以健脾益肾、祛瘀泄浊为DKD的治疗大法，在治疗上选用经验方虫草益肾颗粒（发酵虫草菌丝粉、生黄芪、猫须草、制大黄、水蛭）。方中重用虫草为君，补肺益肾；生黄芪、制大黄为臣，补脾活血泄浊；猫须草（别名肾茶）、水蛭为佐使，利湿破血逐瘀、芳化湿浊，全方温、清、补、消并用，共奏养护正气、祛痰逐瘀、推陈致新之功，对于DKD正虚不足、痰瘀互结、久病失养者颇为适宜。

在本研究中，以24 h为间隔，对72 h内高糖环境下的HMCs增殖情况进行观察，发现72 h内高糖环境下的HMCs增殖特点为双相过程，同时也证实此次研究选择的时点（48、72 h）具有实验意义；同一药物浓度下，不同作用时点的HMCs增殖速度具有明显差异。干预72 h后，虫草益肾颗粒对HMCs增殖的抑制作用更为明显，疗效更好，说明虫草益肾颗粒疗效存在时间依赖性；在同一时间点，随着药物浓度增加，HMCs增殖速度逐渐下降，说明虫草益肾颗粒疗效存在药物浓度依赖性。

在正常的人体中，抗氧化系统会通过抗氧化反应来清除体内的ROS，从而使细胞的氧化还原反应保持在一个动态平衡的状态[16]。但是，当氧化应激反应过度时，人体组织细胞就会出现氧化损伤，进而导致细胞凋亡，并进一步损伤肾脏，引起DKD[17-19]。在肾脏中，ROS的生成与NADPH氧化酶有直接关系[20]，NADPH氧化酶是一个由细胞膜结合色素b558、细胞胞质调节蛋白以及小分子三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）结合蛋白构成的酶复合体，其中细胞膜结合色素b558，主要是由p22phox和gp91phox/NADPH氧化酶2构成，肾脏中ROS便是由表达于HMCs的p22phox产生的[21-23]，因此本研究通过检测p22phox表达情况，以及由p22phox产生的ROS水平，从基因和蛋白水平两个角度来分析虫草益肾颗粒对机体过度氧化应激反应的抑制效果。结果表明，高糖环境下HMCs的ROS水平明显上升，说明HMCs处于高氧化应激状态。药物干预之后，各药物干预组HMCs的ROS水平均明显下降，干预48 h后，仅虫草益肾颗粒高剂量组的疗效优于福辛普利组，干预72 h后，虫草益肾颗粒中、高剂量组的疗效均优于福辛普利组，由此可见，虫草益肾颗粒对于抑制ROS生成的效果存在时间-效应依赖关系。在同一时间点，虫草益肾颗粒高剂量组抑制p22phox表达情况明显优于低、中剂量组，提示虫草益肾颗粒存在剂量效应关系。随着干预时间的延长，干预72 h时虫草益肾颗粒抑制p22phox基因表达的作用强于福辛普利组。通过以上结果可以看出，虫草益肾颗粒抑制p22phox基因表达具有时间效应关系。对于p22phox蛋白表达，干预48 h后虫草益肾颗粒高剂量组抑制p22phox蛋白表达的作用弱于福辛普利组；干预72 h后，两者对p22phox蛋白表达抑制效果持平，分析认为虫草益肾颗粒抑制p22phox蛋白表达的能力弱于福辛普利组，其原因可能与其更长的半衰期有关。从以上结果可以看出，虫草益肾颗粒在抑制ROS生成方面虽然优于福辛普利组，但是在抑制p22phox基因表达和蛋白表达方面则没有明显的优势，这可能是因为虫草益肾颗粒在抑制ROS生成方面有其他信号通路参与。

综上所述，本研究提示虫草益肾颗粒可能通过抑制p22phox基因转录，下调p22phox蛋白表达，来减少细胞内ROS的生成，从而减轻氧化应激反应，延缓DKD的发生发展。