甘蓝型油菜BnMYC2基因克隆及对植物抗虫胁迫的研究

姜 茜，杨 瑶，郭世星,2，吴永成，李 壮,2*

(1 四川农业大学 农学院，成都 611130；2 四川农业大学 油菜研究中心，成都 611130)

油菜(BrassicacampestrisL.)是中国具有传统优势的重要油料作物，其种植面积和产量是继水稻、小麦、玉米和大豆之后的第五大农作物，在调整农业种植结构和提高人民生活水平方面占居重要地位，在农业和农村经济中发挥着重要作用[1]。甘蓝型油菜是白菜(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea) 两个二倍体物种通过种间杂交形成的异源四倍体[2]，是白菜型油菜(BrassicacampestrisL.)、芥菜型油菜(BrassicajunceaL.)和 甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)3种油菜中籽粒产量最高的一种类型。油菜作为中国重要的油料作物和潜在的生物能源作物[3]，受到了斜纹夜蛾和油菜蚜虫等多种害虫的危害，对油菜产量造成了极大的威胁[4-5]。胡留成等[6]研究发现斜纹夜蛾幼虫诱导的油菜抗虫性与茉莉酸(JA)信号转导途径有关。JA的合成是对食草动物取食造成伤害的反应。一些昆虫，如以韧皮部为食的烟粉虱，通过最大限度地减少组织损伤来避免JA防御。烟粉虱取食还能激活水杨酸的合成，从而抑制茉莉酸信号转导[7]。

碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子(TF)MYC2调节不同的JA反应，是第一个被JAZ(Jasmonate ZM-domain，JAZ)蛋白抑制的转录因子[8]，能够与12种JAZ蛋白相互作用[9]。MYC2作为JA信号途径中的主要调节因子，与创伤反应相关，通常被认为有助于防御草食性昆虫[10]。在未诱导的低茉莉酸水平下，JAZ蛋白复合物通过直接与MYC2互作、招募组蛋白脱乙酰酶(HDAC)或抑制RNA聚合酶Ⅱ介导复合物的活性等作用来抑制MYC2的转录活性[11-14]。当植物受到昆虫攻击时，JA通过氧脂生物合成途径快速合成[15-16]，在JA共轭合成酶的作用下，JA与异亮氨酸等氨基酸结合[17]，从而得到高生物活性的茉莉单酰异亮氨酸(JA-Ile)[18]。JA-Ile感知过程中，JAZ抑制子被SCFCOI1靶向蛋白酶体降解，释放MYC2并激活JA应答，正向调节植物对昆虫的抗性[19]。

随着近几年对MYC2转录因子研究的不断深入，发现多种植物的MYC2蛋白在逆境胁迫应答的过程中发挥了重要作用[20-23]。由于甘蓝型油菜染色体组成复杂、遗传转化后连续自交多代才能获得纯系，因此其分子遗传学的进展缓慢。本研究将甘蓝型油菜BnMYC2转化模式植物拟南芥，研究转基因植株对斜纹夜蛾幼虫的抗性，为深入探究甘蓝型油菜对植食性害虫的防御机制以及进一步培育抗虫的油菜品种具有参考借鉴意义。

1 材料和方法

1.1 材 料

实验所用野生型拟南芥Col-0为本实验室保存，拟南芥突变体myc2-2(Salk_083483)购自拟南芥突变体库，甘蓝型油菜恢复系R18的种子为四川农业大学油菜研究中心提供，在四川农业大学教学农场正常播种和田间管理，斜纹夜蛾虫卵购自河南省济源白云实业有限公司，并参照杜鹃等[24]描述的人工饲养方法获得实验所需的三龄幼虫，大肠杆菌DH5α、农杆菌GV3101、pEASY-T1载体、HiFi高保真酶和限制性内切酶XbaⅠ、SalⅠ购自北京全式金生物技术股份有限公司，DNA凝胶回收试剂盒和细菌质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，逆转录试剂及定量 PCR 所需的荧光染料试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司，拟南芥遗传转化的表达载体pCAMBIA1300-HA为四川农业大学陈学伟教授课题组惠赠。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆利用CTAB法提取甘蓝型油菜恢复系R18新鲜叶片的基因组DNA(gDNA)，使用Primer Premier 3在线软件(http://primer3. ut.ee/)，以BnMYC2 的 cDNA 序列 (GenBank 登录号MK571811.1)设计引物(表1)。根据下列体系对BnMYC2基因的编码区进行扩增：DNA 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，BufferⅠ2.5 μL，HiFi DNA聚合酶 0.5 μL，正反引物各0.5 μL，ddH2O 补足体积至25 μL。PCR反应程序：95 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 变性30 s，68 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1.5 min，以后依次降低2 ℃，直到60 ℃，每个退火温度循环2次，95 ℃ 变性30 s， 58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循环20次，共30个循环。72 ℃ 延伸10 min。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，目的片段做胶回收连接到pEASY-T1载体上，转化大肠杆菌DH5α做菌落PCR检测，将阳性菌落扩大培养送擎科生物科技有限公司测序，测序正确的转化子保存备用。

表1 本实验所用引物

1.2.2 序列分析参照程奕秋等[25]的方法应用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对BnMYC2的全长CDS序列进行翻译获得其所编码的蛋白序列，利用Pfam软件对BnMYC2的结构域进行分析。借助DNAMAN软件预测基因所在染色体上的位置。参照邱晓杰等[26]的方法利用MEGA7.0软件，将得到的BnMYC2和其他一些常见物种中该基因编码的蛋白序列进行进化树分析。

1.2.3 基因表达分析根据BnMYC2基因的cDNA序列比对结果设计引物(表1)，分别以甘蓝型油菜的根、茎、叶、花以及授粉后27 d和授粉后35 d果荚的cDNA为模板，BnActin基因为内参，进行实时荧光定量PCR，检测甘蓝型油菜BnMYC2基因在不同组织中的表达水平。PCR的反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45个循环。PCR反应在C1000TM Thermal Cycler PCR仪上进行，CFX96 Real-Time System进行荧光收集，设置3个重复，参照高玉龙等[27]的方法采用2-ΔΔCT法对结果进行分析和处理。

1.2.4 表达载体构建设计含有酶切位点(XbaⅠ/SalⅠ)的引物(表1)，以基因克隆的菌液为模板，进行PCR扩增，将扩增片段连接到线性化的pCAMBIA1300-HA载体上使BnMYC2与HA标签融合表达，重组质粒转化大肠杆菌做菌落PCR检测，将阳性菌落送擎科生物科技有限公司测序，测序显示正确的转化子保存备用。

1.2.5 转化拟南芥利用浸花法将携带重组载体pCAMBIA1300-BnMYC2-HA的农杆菌GV3101转化野生型拟南芥Col-0，22 ℃避光培养24 h后在长日照条件下培养(22 ℃、16 h光照/8 h黑暗)。单株收取T0代种子。利用含有潮霉素的平板进行阳性苗筛选获得T1代幼苗，提取T1代幼苗叶片gDNA，利用hygromycin、BnMYC2两对引物筛选阳性植株(表1)。检测为阳性的植株，收获种子T2代后再利用抗性平板依据植株的表型进行纯合株系筛选，筛选到T3代用于后续实验。

1.2.6 转基因拟南芥的抗虫性鉴定参考You等[28]的实验方法将斜纹夜蛾卵在27 ℃孵化，饲料喂养至3龄后转移到塑料盒中，饥饿12 h后进行饲养试验。从4周龄植株上取45片大小相近的成熟莲座叶并称重，每种基因型放入150 mm塑料培养皿，将15只斜纹夜蛾3龄幼虫，按3个独立重复，每种基因型在一个培养皿中称重，放在叶片上饲养，取食5 h后对叶片进行拍照及称重同时计算叶片损失量。斜纹夜蛾幼虫在培养皿中培养4 d，每2 d更换1次培养皿内的45片鲜叶，取食后4 d称15头幼虫的体重。

1.2.7 转基因拟南芥中抗虫基因VSP2的表达转基因拟南芥的T3代纯系播种在1/2MS培养基上，发芽后生长10 d，再转移幼苗至含 100 μmol/L MeJA的 1/2MS 培养基上继续培养6 h，同时以转移幼苗至只含 1/2MS 培养基继续培养6 h为对照，收取处理的叶片液氮速冻，转入-80 ℃保存，提取RNA做荧光定量PCR检测抗虫基因的表达水平。

2 结果与分析

2.1 油菜BnMYC2基因的克隆

利用引物BnMYC2F/BnMYC2R (表1) 对甘蓝型油菜恢复系R18的gDNA进行扩增，获得2 000 bp左右的片段(图1)，将目的条带回收纯化后连接转化，阳性克隆用特异性引物检测后送擎科生物科技有限公司测序，并用DNAMAN软件进行序列比对。结果显示，该基因从起始密码子ATG到终止密码子TAA之间具有一个1 833 bp完整的开放阅读框(ORF)，与甘蓝型油菜Brassicanapus(MK571811)相似性为97.44%，其基因编码的蛋白由610个氨基酸残基组成。

2.2 油菜BnMYC2基因编码蛋白保守结构域预测

利用Pfam软件对甘蓝型油菜BnMYC2编码蛋白的氨基酸序列进行分析，结果显示该蛋白在第400到500个氨基酸之间有一个HLH(Helix-Loop-Helix)保守结构域(图2，A)，表明BnMYC2为典型的bHLH型转录因子。

2.3 油菜BnMYC2进化树分析

使用NCBI中的Blastp工具对甘蓝型油菜BnMYC2基因序列进行同源检索，利用MEGA 7.0软件对检索到的数据构建系统进化数(图2，B)。结果表明，克隆得到的甘蓝型油菜BnMYC2基因与甘蓝型油菜A5染色体Brassicanapus(CAF2098906)、甘蓝型油菜C7染色体Brassicanapus(XP_013648964)、甘蓝型油菜C6染色体Brassicanapus(XP_013735805)、甘蓝Raphanussativus(XP_018492851.1)、拟南芥Arabidopsisthaliana(NP 174541.1)、萝卜Brassicaoleracea(XP_013586726.1)亲缘关系最近。推测BnMYC2基因的功能可能与甘蓝、拟南芥和萝卜中的同源基因功能类似。

2.4 油菜BnMYC2基因的染色体位置分析

利用DNAMAN软件对BnMYC2基因编码蛋白进行序列比对，结果显示其与甘蓝型油菜A5染色体Brassicanapus(CAF2098906)、甘蓝型油菜C7染色体Brassicanapus(XP_013648964)及甘蓝型油菜C6染色体Brassicanapus(XP_013735805)氨基酸的相似性分别达到97.87%、81.54%、99.34%，推测克隆得到的BnMYC2基因是位于甘蓝型油菜基因组C6染色体的拷贝。

2.5 BnMYC2基因荧光定量PCR分析

通过荧光定量PCR分析BnMYC2基因在油菜各组织的表达水平，结果显示，该基因在油菜各组织中均有表达，但表达水平存在差异，授粉后27 d果荚中BnMYC2基因表达量最显著，叶和根中次之，授粉后35 d果荚中该基因表达量最低(图3)。

2.6 转基因拟南芥植株的筛选鉴定及表达检测

为了研究BnMYC2的功能，将pCAMBIA1300-BnMYC2-HA过表达重组载体转化拟南芥Col-0进行继代培养，每一代转基因植株对同样个体PCR同时检测目的基因和抗性基因片段直至获得纯系。结果(图4)显示，5个转基因纯系株系中均扩增出符合预期大小的特异性条带，选择株系 1用于后续的实验。对Col-0、myc2和BnMYC2-OE进行RT-PCR检测，结果显示，只有过表达植株中检测到BnMYC2基因的表达，表明BnMYC2确实已经转入拟南芥(图5，A)。由于MYC2是JA信号传导路径中的关键因子，为了研究转基因植株在JA诱导下的表现，用100 mmol/L的茉莉酸处理BnMYC2-OE转基因拟南芥，发现处理后BnMYC2基因表达量比对照显著上调(图5，B)，表明BnMYC2响应外源JA的诱导，推测其通过调控下游相关基因的表达，传导甘蓝型油菜的JA信号。

2.7 转基因拟南芥饲养斜纹夜蛾分析

为研究BnMYC2基因对昆虫胁迫的响应，用4周龄Col-0、myc2和BnMYC2-OE的拟南芥叶片饲养饥饿12 h后的3龄斜纹夜蛾幼虫，4 d后观察幼虫形态，结果显示，以myc2饲养的斜纹夜蛾幼虫体型最大，Col-0的次之，取食BnMYC2-OE的最小(图6，A-C)，幼虫形态与叶片危害症状一致(图6，D-F)。对斜纹夜蛾幼虫进行称重统计(图6，G)，显示饥饿处理后，斜纹夜蛾幼虫体重有所下降，取食各基因型叶片后体重均大幅度提升，但取食各基因型拟南芥的幼虫体重与喂食后各基因型拟南芥叶片损失量保持一致(图6，H)，即：myc2>Col-0>BnMYC2-OE，表明BnMYC2基因正向调控拟南芥对抗虫胁迫的响应。

2.8 BnMYC2调节抗虫基因VSP2的表达

VSP2是茉莉酸诱导响应损伤胁迫的标记基因[29]，对植物防御植食性昆虫有着重要作用。为了验证BnMYC2在拟南芥抗虫胁迫中的作用，对BnMYC2-OE拟南芥中VSP2基因表达水平进行分析(图7)，结果显示BnMYC2-OE中的VSP2表达量比Col-0略高，该基因在myc2中的表达水平最低。用MeJA诱导6 h后，VSP2基因在不同基因型拟南芥的表达量都明显增加，与诱导前相比差异显著，表明BnMYC2正向调控VSP2基因的表达，推测BnMYC2通过调控包括VSP2在内的多个标记基因的表达使植物响应虫害胁迫。

3 讨 论

甘蓝型油菜是中国重要的油料作物，菜籽油在食品加工和工业生产上都具有重要作用。油菜的生物学产量受到多种因素的影响，其中虫害胁迫是其主要的制约因素之一[4]。为了提高油菜产量，深入了解其抗虫生理机制十分重要。近年来，针对模式植物拟南芥的研究发现MYC2 是茉莉酸信号传导路径的关键因子，通过调控相关基因的表达影响植物的生长发育。分析基因在多种组织器官的表达模式，可以为充分理解基因的生物学功能提供新的信息[30]。本研究选取了甘蓝型油菜恢复系R18的根、茎、叶、花及授粉后不同时期的果荚，发现授粉后27 d的果荚中BnMYC2表达量最显著，在根、叶中表达水平较高。前人对拟南芥的研究发现AtPLT1和AtPLT2基因能编码维持根茎细胞活性的转录因子AP2和ERF，AtMYC2通过结合AtPLT1和AtPLT2基因启动子的G-box元件抑制基因的表达参与JA介导对根的生长抑制[31]。李罡[32]的研究显示过表达MYC2纯合的大青杨比野生型的不定根生长速度快，而MYC2表达受到抑制的转基因植株的不定根生长较迟缓且生长速度慢。Huang等[33]的研究表明MYC2通过抑制生长素合成负向调控叶脉发育。Qi 等[34]的研究表明MYC2通过与bHLH IIId亚族转录因子相互作用进而调控拟南芥的叶片衰老。甘蓝型油菜与拟南芥同属十字花科植物，BnMYC2与AtMYC2基因同源性高，且具有bHLH型转录因子的保守结构域HLH，推测其在抑制主根生长，正向调控侧根生长、调控叶片衰老等植物生长发育方面具有类似AtMYC2的功能。

斜纹夜蛾是油菜种植过程中最常见的害虫，二龄前幼虫主要危害叶肉，二龄后危害不同的植物组织，受害严重的油菜上半部成光杆，对产量影响很大[5]。通过模式植物拟南芥的研究，前人发现MYC2正向调控受茉莉酸诱导的多个抗虫基因，从而增强对虫害的抵御能力[19, 33]。本研究发现斜纹夜蛾幼虫对过表达BnMYC2拟南芥植株的取食量最少，幼虫的体重相应增加的程度最小，反之斜纹夜蛾幼虫对myc2缺失突变体的取食量最多，幼虫的体重相应增加的程度最大。抗虫基因VSP2的表达水平也表现出相应的变化，并且其表达量用MeJA短暂处理后呈现显著的变化趋势。该研究结果与前人的报道类似[35-38]。上述结果为深入探究BnMYC2介导抗虫胁迫的机制奠定了一定基础，也为培育抗虫的油菜品种提供一些新的思路。