高效液相色谱-原子荧光光谱联用法对婴幼儿奶粉和辅食中不同形态汞的测定

杨娟，平文卉，叶青华，张颖茜，王金鑫，戴志英

分析检测

高效液相色谱-原子荧光光谱联用法对婴幼儿奶粉和辅食中不同形态汞的测定

杨娟，平文卉，叶青华，张颖茜，王金鑫，戴志英

（南通市疾病预防控制中心， 江苏 南通 226007）

采用高效液相色谱-原子荧光联用仪测定婴幼儿奶粉和辅食中不同形态汞含量。样品用冰浴超声振荡提取后用离心机将样液离心分离，分离好的上清液用氢氧化钠溶液调节pH值，过膜后经过形态分析仪预处理，由高效液相色谱分离，最后用原子荧光光度计检测。甲基汞、乙基汞和二价汞3 种形态汞标准曲线的线性范围0～10 μg·L-1；相关系数均大于0.99；检出限分别为 0.51、0.50、0.52 μg·L-1；平均加标回收率为 90.8%～109.3%；RSD为1.76%～7.07%。该法测定婴幼儿奶粉和辅食形态汞含量，方法的精密度和准确度及线性关系均比较满意，适合用于婴幼儿奶粉和辅食形态汞含量的测定。

高效液相色谱-原子荧光联用法； 婴幼儿奶粉和辅食； 形态汞

近几年，随着生活水平的提高，食品安全问题受到人民群众的关注，二胎政策放开之后，奶粉、辅食量需求量增高，其安全问题成为父母首要关注的问题[1]。

汞具有易挥发、易富集的特点[2]。毒性有机汞高于无机汞，有机汞中甲基汞毒性最大。甲基汞很容易穿过血脑屏障并损害人的神经系统与免疫系统。有机汞是一种亲脂性有机化合物，很容易在食物链中富集。被人体吸收后，大多数无机汞会在肾脏中积累，对肾脏造成不可逆转的损害，甲基汞更可能是人体致癌物。

由于汞对人类健康造成的巨大损害，汞污染在世界范围内变得越来越重要。由于汞不可降解性和强大的生物蓄积性，土壤和水中的汞经过生物蓄积后会进入食品原料，从而危害人体健康。水和土壤中的汞通过微生物甲基化并通过食物链逐渐富集在鱼类等水产动物中，因此，鱼类等水产动物食品中甲基汞的含量普遍高于其周边环境。由于滥用农药，化工厂等排污不当，所以植物食物容易被汞污染，在微生物的作用下，无机汞转化为甲基汞[3]。此外，食物在采集、运输、加工和包装过程中，溶解在金属容器中的汞和含汞的食品添加剂也可能会污染食品，尤其是奶制品，现在女性工作压力大，事业和家庭兼顾，晚婚晚育的现象普遍存在，生育后很多要么奶水不足，要么背奶，要么干脆选择配方乳，因为对于婴幼儿来说配方乳的需求量巨大，然而国内出现过三鹿毒奶粉事件后，妈妈对选择奶粉方便更加谨慎，奶粉的安全性，奶源的安全性都很重视，因为加强配方奶粉和辅食质量的监测监管非常有必要。

对于水样，特别是饮用水，预处理萃取快速而简单[4-7]，对于食品样品，尤其是奶粉和辅食样品中含有脂肪，蛋白质和其他复杂结构的物质。在预处理过程中将使用大量的酸和萃取剂，萃取过程环节复杂，影响提取效率，进而影响检测结果，并且污染环境[8-13]，因而前处理过程至关重要。

目前不同形态汞的测定方法主要是液相色谱-原子荧光光谱联用法（HPLC-AFS）和液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法（HPLC-ICP-MS）[14]。两种方法相比, HPLC-AFS仪器结构简单、仪器耗材成本低、灵敏度高、选择性好和普及广等优点，因而使用该方法检测有机汞的频率相对高，国内外报道的机会比较多，方法也相对成熟。

在这项工作中，使用5 mol·L-1HCl溶液超声提取样品中的汞。使用6 mol·L-1NaOH溶液将样品的pH调节至2～7。C18反相色谱柱分离，在流动相中添加L-半胱氨酸作为汞配合物，在紫外线照射下甲基汞转化为无机汞，在酸性条件下，无机汞与硼氢化钾在线反应生成汞蒸气，通过原子荧光光谱法[15]用于检测不同形式的汞。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

SAP-10液相色谱-原子荧光光谱联用仪，艾杰尔反相C18分析柱，汞空心阴极灯，KQ-300TDB型高频数控超声波清洗器，BI0FUGE PRlM0 R230冷冻离心机，JY10002电子天平。

1 000 mg·L-1汞标准溶液(北京有色金属研究院)；

甲基汞标准溶液(65.2±2.5 μg·g-1，中国计量科学研究院，GBW08675)；

乙基汞标准溶液(70.6±2.5 μg·g-1，中国计量科学研究院，GBW（E）081524)；

湖底沉积物中甲基汞及无机元素标准物质（甲基汞5.2±0.7 ng·g-1, 总汞0.48±0.03 μg·g-1中国计量科学研究院，GBW08308）；

甲醇(色谱纯)；L-半胱氨酸(生化试剂)，国药集团；硼氢化钾：SIGMA;盐酸(优级纯)；乙酸铵、氢氧化钠：分析纯，国药集团；

液相流动相：5%甲醇、0.1% L-半胱氨酸、0.06 mol·L-1乙酸铵，称取1.21 g L-半胱氨酸，4.62 g乙酸铵，放入1 L的容量瓶中，加入超纯水超声溶解，再加入50 mL色谱纯甲醇，用超纯水定容至1 L，用溶剂过滤器过水相膜抽滤，水浴超声30 min，流动相需现用现配。

形态分析试剂：7%盐酸溶液作为载流，20 g·L-1硼氢化钾溶液作为还原剂，准确称取20.0 g硼氢化钾，用3.5 g·L-1氢氧化钾溶液溶解并稀释至1 L，现用现配。

1.2 仪器工作条件

液相色谱：C18色谱分析柱(150 mm×4.6 mm×5 um)，C18预柱(10 mm×4.6 mm×5 um)，泵流速1.0 mL·min-1，进样体积0.1 mL 。

原子荧光：负高压280 V，汞灯电流40 mA，载气流速400 mL·min-1，屏蔽气流速600 mL·min-1。

形态分析预处理装置条件：泵速：60 r·min-1，紫外灯（UV）开。

1.3 试验方法

称取奶粉和辅食样品约0.50～2.0 g，置于15 mL 聚丙烯离心管中，加入10 mL 5 mol·L-1现配盐酸溶液，摇匀放置冰箱冷藏过夜。空调制冷温度下冰浴超声提取60 min，期间振摇数次。4 ℃下以8 000 r· min-1转速离心15 min。准确吸取2.0 mL上清液至5 mL容量瓶或者刻度试管中（刻度试管置于冰水混合物中），逐滴加入6 mol·L-1氢氧化钠溶液，边滴边迅速摇匀，使样液pH值在2～7之间。加入0.1 mL 10 g·L-1的L-半胱氨酸溶液，最后用水定容至刻度。最后经0.45μm水相滤膜过滤，待测。同时做空白试验。将处理好的试样溶液100 μL注入液相色谱-原子荧光光谱联用仪中，检测得到3种汞形态色谱图，用外标峰面积法定量计算出样品中3种形态汞含量。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

元素形态分析需要对样品进行复杂的前处理,包括化学提取和富集。汞不同形态的提取方法主要包括碱消解法和酸提取法；由于甲基汞是一种脂溶性化合物, 通常与蛋白质和其他物质结合。通过查文献得知陈德泉等人的工作证明在众多酸碱提取剂中盐酸的提取率是最高的，并且不会出现乳化现象，因此本实验在超声辅助作用下用盐酸萃取的,通过加标回收实验证明, 提取过程中汞没有发生形态之间的转化因此选择盐酸作为萃取剂来提取。常用的络合剂主要有L-半胱氨酸和硫脲，本实验选择L-半胱氨酸。

2.2 试验条件优化

含有汞的样品在超声提取时，随着超声产热，水温逐渐升高，汞化合物极易挥发，所以，在水中可加入冰块来控制水温上升或者采用可以制冷的超声仪进行超声提取。在用氢氧化钠溶液调样品pH值时，因样品预处理加入的盐酸和调pH值用的氢氧化钠发生中和反应会迅速升温，导致汞化合物挥发检测结果偏低。因此样品在调pH值时需在冰浴下进行，边加氢氧化钠边震荡混匀让产生的热释放到冰水混合物中。加标回收试验证明，温度对实验结果影响比较大，控制前处理温度至关重要。

2.3 标准曲线和检出限

由于有机汞是剧毒品，本实验标准系列范围确定低浓度0～10 μg·L-1，实验证明，满足检测要求。分別吸取1 μg·mL-1的甲基汞、乙基汞和汞混标溶液0, 20, 40, 60, 80, 100 μL于10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，配制成浓度分别为0、2、4、6、8、10 μg·L-1的标准系列，吸取100μL标准系列溶液进行测定，分别以色谱峰面积为纵坐标，以甲基汞、乙基汞和二价汞的浓度为横坐标，绘制标准曲线，以10倍信噪比计算检出下限。线性回归方程、相关系数和检出下限见表1。

表1 方法的线性关系、相关系数和检出下限

2.4 加标回收实验和精密度

分别向奶粉样品中加入质量浓度为2.0、6.0、10.0 μg·L-13种不同形态的汞标化合物进行加标回收实验，平行测定6次，得到加标回收率和相对标准偏差结果见表2。甲基汞的加标回收率为94.7%～103.5%，乙基汞为95.6%～107.0%，二价汞为90.8%～109.3%，表明该方法测定准确度较高。甲基汞的相对标准偏差（RSD）为1.76%～3.63%，乙基汞为1.94%～2.52%，二价汞为3.79%～7.07%，表明甲基汞和乙基汞稳定性比较好，二价汞稳定性欠缺，可能和二价汞易挥发的性质相关。

表2 奶粉样品加标回收率和相对标准偏差（n=6）

2.5 方法准确度实验

采用 HPLC-AFS 法对质控样品GBW08308湖底沉积物中不同形态汞的含量进行测定, 检测得甲基汞的质量分数为5.02 μg·kg-1（湖底沉积物质控样品证书中甲基汞质量分数为5.2±0.7μg·kg-1），测得值与证书中中位值基本吻合，从而验证了本方法具有较高的准确性。

2.6 实际样品检测实验

采用 HPLC-AFS 法对20份奶粉、10份辅食样品中不同形态汞的含量进行测定, 其中辅食样品中有1份深海鳕鱼肠检出甲基汞的质量分数为3.65 μg·kg-1, 乙基汞质量分数为 0.86 μg·kg-1, 二价汞质量分数为 2.59 μg·kg-1，用全自动测汞仪测定总汞质量分数为38.0 μg·kg-1。不同形态汞混合标准溶液(3种形态汞质量浓度均为6.0 μg·L-1)的测定图谱如图1 所示, 深海鳕鱼肠样品的测定图谱如图2 所示。

3 结 论

实验运用 HPLC-AFS 法对婴幼儿奶粉以及辅食中不同形态的汞含量进行测定, 建立了婴幼儿奶粉以及辅食中不同形态汞的提取、分离方法, 通过对质控标准样GBW08308湖底沉积物中的不同形态汞进行检测, 其中甲基汞检测结果和证书中甲基汞的值很接近，该方法操作简便快捷、准确度很高、重复性很好, 适合用于对婴幼儿奶粉以及辅食中不同形态汞以及总汞含量的检测。实际样品检测得出，奶粉样品未检出总汞和有机汞，说明婴幼儿奶粉质量有一定的保障，不管是国产的还是进口的均未出现超标样品。

图1 HPLC-AFS法测定混和标准溶液色谱图

图2 HPLC-AFS法测定深海鳕鱼肠色谱图

虽然检出率不高，奶粉未检出，但是婴幼儿乳制品重金属污染物限量指标的国家标准缺失，对于乳制品生产企业监管难度会加大，乳制品生产企业的质量完全靠自律，婴幼儿奶粉质量安全方面的问题存在一定的隐患。呼吁制定严格详细的标准才能应对防不胜防的乳品安全质量问题。

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Determination of Different Forms of Mercury in Infant Milk Powder and Complementary Food by High Performance Liquid Chromatography-Atomic Fluorescence Spectrometry

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（Nantong Center for Disease Control and Prevention, Nantong Jiangsu 226007, China）

High-performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry was used to determine the different forms of mercury in infant formula and complementary foods.The sample was extracted by ultrasonic shaking with an ice bath, and then centrifuged to separate the sample solution. The separated supernatant was adjusted to pH with sodium hydroxide solution, passed through a membrane and pretreated by a spectrometer, and separated by high performance liquid chromatography. At last, it was detected with the atomic fluorescence spectrometer. The linear range of the three standard mercury profiles of methylmercury,ethylmercury and divalent mercury was 0～10 μg·L-1;The correlation coefficient was greater than 0.99;The detection limits were 0.51,0.50,0.52 μg·L-1,respectively;The average spike recovery was 90.8%～109.3%;The RSD was 1.76%～7.07%. The precision,accuracy and linearity of the method are satisfactory. It is suitable for the determination of mercury content in infant formula and food supplement.

High performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry; Infant formula and complementary food; Morphology mercury

南通市科技局（项目编号：YYZ17092；MS12017018-6）。

2021-11-26

杨娟（1985-），女，河南省项城市人，工程师，硕士，2013年毕业于扬州大学学校分析化学专业，研究方向：理化检验技术。

戴志英（1967-），女，高级工程师，研究方向：理化检验技术。

TQ462.24

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1004-0935（2022）03-0434-04